2021 Fiscal Year Research-status Report
Bookmarking function of p63, a nuclear marker of oral carcinomas
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20K09927
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| Research Institution | Kanagawa Dental College |
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Principal Investigator |
加藤 伊陽子 神奈川歯科大学, 歯学部, 特任教授 (20333297)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
倉田 俊一 神奈川歯科大学, 歯学部, 特任教授 (60140901)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | TP63 / 口腔癌 / p300 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
p63(TP63)はがん抑制遺伝子p53ファミリーの遺伝子であるが、発現に組織特異性があり、口腔癌や皮膚癌で強く発現する。p53のようにトランスアクチベーションドメイン(TA)を持つTA-p63タンパク質はごく微量で、TAを持たないΔN-p63、特にスプライスバリアントΔN-p63-αが圧倒的に多く産生される。ΔN-p63-αがヒストンアセチル基転移酵素（HAT）活性を持つp300と結合するが、その結合によりクロマチンにブックマークを付けると考えられることから、本研究ではp63-p300の結合とそれによる転写制御に関して解析を行っている。
p300をセグメントに分割し、すべてがN末端の核移行シグナルを持つように改変し、C末端にタグ(3xFlag)を付して発現させた。ΔN-p63-αおよびTA-p63-αにはHAタグを付した。抗HA抗体と抗Flag抗体よる免疫沈降(IP)を実施し、共沈するタンパク質（セグメント）をウエスタンブロットで検出した。さらに機能を解析する一環として、Lucレポータアッセイを行い、βカテニン依存性の転写誘導に関して、p300結合因子として最初に報告されたアデノウイルスE1aとΔN-p63-αがLuc発現に及ぼす影響を調べた。
その結果、HAおよびFlagのIPによりTA-p63-αとΔN-p63-αはどちらもp300のHAT酵素配列を含む領域に結合することが示唆された。それに加えてTA-p63はTAZ1ドメインにも、ΔN-p63はKIXドメインにも親和性を示した。この結果はp63による転写制御メカニズムについての新しい知見につながる。さらに、Lucレポータ・アッセイではp63がβカテニンによるLuc発現を促進し、それをE1aが抑制した。結合部位は異なるが、機能的な相互作用があると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画と研究進捗状況を単純に比較すると少し遅れているが、実施した内容は計画よりも充実し、得られた結果も重要性が高く、今後の発展性を考える上では想定を上回っている。p63のαドメインのp300分子上の結合部位として、多様な転写制御因子が特異的に結合するTAZ1、KIX、TAZ2、NCBDではなく、HAT酵素活性中心の近傍であるという実験結果は、p63のブックマーキング機能を理解する上で非常に重要である。タンパク質折り畳み構造によって2つの領域に生じる正と負の電荷を介して結合する可能性が考えられる。
さらに、p63の機能を総合的に理解するためには、p63の異なるアイソフォームとp300との結合を調べる必要性がある。そのため、当初予定していたΔN-p63-αだけでなく、N末端にTAドメインを持ちp53と類似の構造をしているTA-p63-αについて平行してIPの実験を行った。得られた結果（研究実績の概要に記載）はこれまで報告されておらず、新しい展開につながる。
また、Lucアッセイを実施することにより、他の転写制御因子との競合・協働を調べることができるようになった。特に今回βカテニンによる転写活性化の実験系で、p63が転写促進作用を示し、それに対してE1aによる抑制効果が検出され、多数の因子による多様な制御にp63が加わる可能性を示している。
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| Strategy for Future Research Activity |
p63の「ブックマーキング機能」の解析に関して主に次の２つの方向から研究を推進する。
(1）p63-p300の結合機序の解析。進行中の分子結合の解析を進展させ、ドメインやセグメントを狭め、結合部位とそのメカニズムを明らかにする。可能なら変異導入により結合に関与するアミノ酸を決定する。実験の問題点として、p300セグメントには3コピーのFlagが連結されているが、p63タンパク質が持つHAタグは１コピーであるため、ウエスタンブロットでp63を検出する効率が悪い。当初から予想されたことではあるが、興味深い結果が出つつあり、今後の実験をより確実かつ迅速に行うためには、ｐ63のアイソフォームや変異体を新しいベクターに組換えて3ｘHAタグをつけて発現させる必要がある。
(2) p63によるクロマチン修飾、特にヒストンアセチル化を明らかにし、遺伝子発現に及ぼす影響を明らかにする。p63を発現している口腔癌の培養細胞株でH3K9acまたはH3K27ac抗体を使用し、ChIP-Seq解析を行う。さらにsiRNAによるp63のノックダウンを行い、ヒストンアセチル化の変化を調べ、遺伝子発現の変化と相関性があるかどうかを検討する。表皮細胞特異的に発現する遺伝子に着目する。
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| Causes of Carryover |
研究の進行を考慮し、目的の達成に目処をつけるために研究実施項目を2021年度と2020年度で調整した。2021年度に実施予定であったChIP-Seqを2022年度の項目とし、それに代えて機能解析としてLucアッセイを行った。次年度使用額が生じているが、後ろ倒しにしたChIP-Seq解析の経費であり、総研究期間（3年）を通じて研究内容と経費総額の変更はない。
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Research Products
(1 results)
