2020 Fiscal Year Research-status Report
WNT・メカノシグナルによる歯根膜幹細胞エクソソームの最適化と歯周組織再生制御
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20K09933
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
根本 英二 東北大学, 歯学研究科, 准教授 (40292221)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 茂樹 東北大学, 大学病院, 講師 (30549762)
山田 聡 東北大学, 歯学研究科, 教授 (40359849)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 歯根膜細胞 / エクソソーム / WNTシグナル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト歯根膜間葉系幹細胞は抜去された健全な第三大臼歯より歯根膜を採取し、酵素処理後、抗STRO-1 抗体を用いたマグネチックビーズ法によりSTRO-1 陽性細胞を分離・培養することによって回収した。回収した同細胞について間葉系幹細胞マーカーの発現をフローサイトメーターで確認し,また専用培地を用いて骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨芽細胞に誘導し、その多分化能を確認した。さらに、ヒト歯根膜間葉系幹細胞に加えて、マウス由来の細胞として、マウス不死化歯小嚢細胞をNIDCR、Somerman M.博士よりに分与を受け、本年度の実験に使用した。PDL幹細胞から分泌されるエクソソームに対して、WNT刺激及びメカノシグナル刺激がどのような影響を及ぼすか検討する目的で、まずWNT刺激による影響に焦点を当てて実験を行なった。PDL幹細胞のWntシグナルの活性化は,100 ng/mlリコンビナントWNT3AあるいはWNTアゴニスト化合物、LiClを用い、48時間後に細胞培養上清を回収した。PureExo単離キットを用いてエクソソームの回収、精製を行なったところ、分泌量に関してはWNT刺激の有無による有意差は認められなかった。また、マウス不死化歯小嚢細胞を用いても同様に実験を行なったところ、分泌量に関して特に両群に有意差は認められなかった。マウス不死化歯小嚢細胞を上述のエクソソーム存在下で培養したところ、アルカリンホスファターゼの酵素活性及び遺伝子発現が有意に誘導されることを確認することができた。しかしながら、細胞増殖能についてはMTT試薬を用いた比色法で、特に有意な誘導は認められなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度の研究計画である、Wntシグナルにより分泌されるエクソソームと細胞分化誘導の最適条件の検討に関して，上記の刺激・培養条件において硬組織分化マーカーの１つであるアルカリンホスファターゼの発現が有意に上昇することが明らかとなったことから，その解析を含め、そのほかの硬組織分化マーカーの発現の解析を次年度以降の継続課題とすることができる。これらの反応を基盤とすることで，次年度以降に予定しているメカノシグナルによるエクソソーム機能に与える影響、及びそれらコンビネーション刺激による影響について、スムーズに解析を行うことができることから、現在までの研究の達成度は概ね順調と言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度の研究成果，すなわちWntシグナルにより分泌されるエクソソームには硬組織分化マーカーを誘導する機能が具備されるという反応系に対して、今後はさらにメカノシグナルにより、その硬組織分化誘導活性を増強する可能性について注力していく。それらを確実に検証したのち、エクソソームに内包されているmiRNAを抽出し,網羅的miRNA解析につなげていく。
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| Causes of Carryover |
世界的なコロナ感染拡大の情勢により、輸入研究試薬の一部の納品が当該年度内に完了できないことが判明した。この未使用額に関しては、翌年度分として請求した助成金と合わせた物品費としての使用計画とした。
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