間葉系幹細胞のStemnessを維持する代謝系制御培養基板の開発

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09994
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 平田 伊佐雄 広島大学, 医系科学研究科(歯), 助教 (40346507)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 金輪 真佐美 (福永真佐美) 広島大学, 自然科学研究支援開発センター, 助教 (00284208) ; 森田 晃司 広島大学, 病院(歯), 助教 (30555149) ; 加藤 功一 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (50283875)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 間葉系幹細胞 / 培養基板 / 幹細胞性 / 代謝

Outline of Annual Research Achievements

間葉系幹細胞(MSC)を用いた骨組織再生医療において、培養細胞の品質維持の重要性は急速に高まっている。特に幹細胞の大量培養において自己複製能と多分化能、すなわち幹細胞性(Stemness)を維持することは極めて重要となる。MSCは標準的な培養方法で簡易に取り扱える細胞であるが、継代毎に増殖能及び分化能が劣化しやすく、大量培養時のStemness維持が困難な欠点も有する。近年、幹細胞のStemnessにおける代謝系調整・制御の重要性が多く報告されている。
本研究は、以下の３段階を経て、申請者がこれまで培った表面処理技術ならびに解析技術をもとに、培養基板表面へbFGFやCripto-1等の代謝系制御サイトカインを固定化することで、MSC培養での代謝系制御がStemness維持に及ぼす影響の程度を明らかにし、MSCのStemnessを維持しつつ短期間での大量培養に最適化された代謝系制御培養基板の開発を目指す。
①「細胞活性能を有するHis-tag含有サイトカイン合成法」②「His-tag含有サイトカインの培養基板表面への固定化法」③「サイトカイン固定化基板上でのMSCの増殖能とStemness維持能」。令和２年度は①を主に行った。
①において、Cripto-1をベースとしたキメラタンパクのDNA配列を設計し、pET22(+)およびpGEX-6P-1プラスミドベクターに導入した。このベクターを大腸菌B系統株に導入し、設計したリコンビナントタンパク質を合成した。現在、Cripto-1キメラタンパク質のリフォールディング能および合成量に難が生じており、キメラタンパクの設計及び大腸菌発現条件を色々と変えて、合成効率を向上する条件を探索した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Covid-19の影響により研究開始が4ヶ月ほど遅延したことと、Cripto-1キメラタンパクの合成量が予想以上に低く、また、リフォールディングも正しく行われていない可能性があるため。

Strategy for Future Research Activity

リフォールディング能の高い大腸菌ホスト株を取得し、Cripto-1キメラタンパクの合成条件を検討する。また、Cripto-1キメラタンパクが満足に取得できなかった場合、過去に合成実績のあるbFGFを主軸にして研究を遂行していく。

Causes of Carryover

Covid-19の影響により研究開始が遅延したため。
現時点でもCovid-19による影響（特に研究使用物品の納品遅延および未定）があるが、消耗品等を事前にストックしていくことにより、研究が遅延する外的要因をなるべく減らしていく。