間葉系幹細胞のStemnessを維持する代謝系制御培養基板の開発

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09994
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 平田 伊佐雄 広島大学, 医系科学研究科(歯), 助教 (40346507)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 金輪 真佐美 (福永真佐美) 広島大学, 自然科学研究支援開発センター, 助教 (00284208) ; 森田 晃司 広島大学, 病院(歯), 助教 (30555149) ; 加藤 功一 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (50283875)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 間葉系幹細胞 / 培養基板 / 幹細胞性 / 代謝

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、近年の生化学・分子生物学的な視点を踏まえた上で、表面改質による代謝系制御機能を付与したMSC培養基板、すなわちbFGFやCripto-1等のサイトカインを培地ではなく培養基板表面に固定化することでMSCの高品質大量培養に最適化された基板の設計・開発を目指す。
代謝的な視点において、幹細胞のStemness維持には嫌気性解糖系の活性化が重要であること、具体的にはbFGF/bFGFRやCripto-1/GRP78等のサイトカイン/レセプター複合体形成によるMSCの解糖系の活性化及び細胞内代謝生成物である活性酸素種(ROS)の減少がStemness維持に重要であることが報告されている。よって、これらのサイトカインを基板表面に多く固定化することでサイトカイン/レセプター複合体形成量の大幅な上昇によるMSCのStemness維持が期待できる。
令和3年度は、令和2年度から引き続き、基板に固定部位を有するサイトカインのキメラタンパク質の合成条件について複数検討してきた。最終的に、Cripto-1をベースとしたキメラタンパクを設計し、pColdIプラスミドベクターに導入した。このベクターを大腸菌B系統株(Rosseta-Gami系)に導入し、低温発現によりGST-HRV-Cripto-1-GGGGS3H6を可溶体として合成した。また、bFGFをベースとしたキメラタンパクを設計し、pET22(+)プラスミドベクターに導入した。このベクターを大腸菌B系統株に導入し、bFGF-GGGGS3H6を可溶体として合成した。
これらのキメラタンパク質は、NTA基が導入された基板上に固定することが可能であり、これより、サイトカイン固定化基板上でのMSCの増殖能とStemness維持能についての検討を行っていく。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Cripto-1キメラタンパクの合成量などに問題を抱えていたため、最終的には目的を達したが、本タンパクの発現条件の確定に手間取ってしまったこと。
また、Covid-19の影響により実験に用いる物品の納品遅延が頻繁に生じたため。

Strategy for Future Research Activity

基板に固定可能なタンパクの合成は達成したので、今後は、サイトカイン固定化基板上でのMSCの増殖能とStemness維持能についての検討を推進していく。

Causes of Carryover

Covid-19の影響により研究開始が遅延したため。
現時点でもCovid-19による影響（特に研究使用物品の納品遅延および未定）があるが、消耗品等を事前にストックしていくことにより、研究が遅延する外的要因をなるべく減らしていく。