2021 Fiscal Year Research-status Report
The mechanism of differentiation of periodontal tissue with the long-term organ culture system.
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20K10000
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| Research Institution | Tsurumi University |
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Principal Investigator |
寺島 達夫 鶴見大学, 歯学部, 非常勤講師 (20114770)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大井田 新一郎 鶴見大学, 名誉教授, 名誉教授 (10114745)
山本 竜司 鶴見大学, 歯学部, 講師 (20410053)
唐木田 丈夫 鶴見大学, 歯学部, 講師 (40367305)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 歯根膜形成 / 器官培養法 / 分化誘導 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯胚構成成分として、顎骨骨膜由来成分を含まない胎生16日齢のマウス臼歯と、歯胚の最外層をなす歯小嚢に骨膜由来成分が付着した胎生17.5日齢以降のマウス臼歯を用いて、6～10週間の長期間器官培養法をおこなった結果、胎生16日齢のマウス臼歯歯胚の長期間器官培養法では形成された歯根の表面にはセメント質および歯根膜の形成が認められたが、形成された歯根に面した部位には歯槽骨の形成が認められなかった。一方、歯小嚢に顎骨の骨膜由来成分が付着した胎生17.5日齢以降のマウス臼歯歯胚の長期間器官培養では、形成された歯根にはセメント質および歯根膜線維の形成と歯根に面した部位には骨形成が認められた。
異所性骨形成を抑制するRapamycinを添加した歯胚の長期間器官培養を用いて、器官培養が困難であった胎生18.5日齢の歯胚の器官培養をおこない、形成された歯胚全体の外形はやや小型化するが、エナメル形成や石灰化および歯根形成が認められたが、歯胚周囲には異所性骨組織の形成は観察されなかった。この実験結果はRapamycin添加が胎生18.5日齢の歯胚培養の可能性を示唆していた。
歯胚の長期間器官培養の際には、培地に添加する牛胎児血清の性質が重要な影響を与えるため、新規の血清を用いる際にはロットチェックが必須であるが、新規の血清の入手が困難となり、さらに、1回の血清のロットチェックに最低4カ月間必要であった、前年度から当該年度にかけて計3回、延べ8種の血清のロットチェックをおこなった。従来用いていた牛胎児血清より優れた培養結果を示す血清は得られなかったが、ほぼ同等な培養結果を示す血清を選定することができ、次年度に繰り越した研究に使用することが可能となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
歯胚の長期間器官培養に必須である培地に添加する従来から用いていた最適な牛胎児血清の在庫が前年度の後半に無くなり、新たに血清を更新する必要が生じたことから、血清のロットチェックをおこなってきた。歯根形成を目的とする歯胚の器官培養には8～10週間という長期間の培養が必要であり、1回のロットチェックの結果の判定に約4ヶ月要することやコロナ感染症の影響などで、牛胎児血清のロットチェックをおこなうための新たな血清の入手が遅延したことなどにより、血清のロットチェック実施計画に遅れが生じた。
さらに、ロットチェックをおこなった結果、従来用いていた牛胎児血清より優れた培養結果を示す血清が得られなかったため、新たに牛胎児血清を入手して、ロットチェックを繰り返した結果、従来用いていた牛胎児血清とほぼ同等な培養結果を示す血清を選定することができたことにより、歯胚の長期間器官培養実験が再び可能となった。
血清のロットチェックに長時間要した結果、本研究課題で実際に予定していた器官培養実験の大部分を当該年度におこなうことができず、次年度に培養実験を繰り越すことになった結果、本研究課題の進捗が遅れた原因となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
器官歯胚歯胚における歯根の歯周組織の形成能の検索に関しては、新しい牛胎児血清を用いて、当該年度でおこなえなかった器官培養実験を次年度に繰り越すとともに、実験数を増やし、さらに、胎生18日齢の歯胚の長期間器官培養系にRapamycin を適用して、形成された歯根膜を含む歯周組織形成を組織学的に観察し、さらにアルカリホスファターゼ(ALP)などの酵素活性を調べることにより、歯周組織、特に歯根膜形成の影響を検討する。
動物実験系での歯周組織の分化形成能の検索に関しては、歯周組織はセメント質、歯根膜および歯槽骨から成る複雑な組織で、培養系ではそれらの高次構造を観察するのは困難であり、動物に歯胚を移植し高次構造の形成を観察する。その際、分化した細胞の由来を明確にするために、GFPマウスを用いてGFPで標識された細胞を持つマウスの歯胚を通常マウスの皮下に移植し、歯周組織、特に歯根膜へ分化する細胞の由来を確認する。
培養系での歯周組織への分化誘導機構の検討に関しては、器官培養系にBMPやTGF-βの阻害剤を用いて歯根形成の影響を確認し、さらに異所性骨形成を阻害するRapamycin を培養系に添加して、歯根形成を観察し、骨芽細胞や歯根膜細胞に関する分化マーカーの発現をPCRや免疫組織化学で観察する。
以上の観察により、歯根形成における歯周組織特に歯根膜への分化機構を検討する。
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| Causes of Carryover |
歯胚の長期間器官培養には最適な牛胎児血清の使用が必須であるが、従来より使用していた最適な血清の在庫が前年度の後半に無くなったことから、新たに血清を更新する必要が生じ、牛胎児血清のロットチェックをおこなってきたが、今まで用いていた血清と同程度の効果を示す血清を選定することが出来なかった。そのため、再度新しい血清を入手して、血清のロットチェックをおこなったことにより、今まで用いていた血清と同程度の歯胚長期間器官培養での培養成果を示す血清を選定することができた。
血清のロットチェックによる牛胎児血清の選定が遅れたため、当該研究期間に予定していた器官培養実験の大部分の実験計画を実施することができず、次年度に残りの培養実験を繰り越すことになった。
次年度に繰り越した使用額はロットチェックで良好な培養結果を示した血清の購入と当該年度から次年度に繰り越した歯根形成の器官培養実験に必要な培地や試薬や培養器具ならびに実験動物の購入と、培養実験後の組織学的観察に必要な器具、試薬の購入に使用する。次年度に繰り越した培養実験の実施回数を増加することと、当該年までの実験結果と組み合わせることにより、本研究の遅れを取り戻せると考えられる。
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