2020 Fiscal Year Research-status Report
バンク事業の進む歯髄幹細胞の臨床応用に向けたメッセージの発信
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20K10019
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| Research Institution | The Nippon Dental University |
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Principal Investigator |
大越 章吾 日本歯科大学, 新潟生命歯学部, 教授 (70231199)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中原 貴 日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (10366768)
石川 博 筑波大学, 医学医療系, 研究員 (30089784)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 歯髄細胞 / 間葉系幹細胞 / 肝細胞 / ヒト特異的プライマー / 組織生着率 / 歯の細胞バンク / 免疫不全ラット / 再生医療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らは、歯髄間葉系幹細胞(Mesenchymal Stem Cells; 以下MSCと略)が肝細胞の形態を有し、アルブミン産生能、アンモニア代謝能、肝細胞特異的な転写因子のHNF-4αを特異的に発現する細胞に分化することを示した。また、ラットの肝障害モデルに細胞投与を行うと肝障害の程度が改善した（J of Hard Tissue Biology 29; 215-222, 2020）。
これらの研究によって、歯髄MSCが肝細胞の形質を有する細胞に分化し、肝炎を改善することが明らかになった。また、今後、現在既に事業化されている歯の細胞バンクを利用して、細胞を医療に応用できる道筋の一つが視界に入ってきた。しかしながら歯髄MSCが何故肝障害を改善したかについては未解決の問題として残った。
そこで本研究の学術的「問い」は以下のものである。歯髄MSCに重症肝炎の治療効果があるのなら、それはどのような機序によるのか？細胞が分泌するCytokineなどによるParacrine抗炎症作用が主体なのか？細胞自体が肝に生存して組織修復を行う作用が主体なのか？
歯髄MSCには骨髄MSCに比してより高い分化能、増殖能があるという報告がある(Odontology, 2013)。更に歯髄MSCは特に臓器へのHoming機能に優れているのか、特定のCytokineやChemokineを誘導しやすいのかなどの優れた特徴があるのであろうか？それが明らかになればバンク化された歯髄細胞が再生医療資源としてどのような効果を発揮し、どのような疾患に有用なのかという臨床応用のメッセージを発信できる。
特に申請者らはまず歯髄MSCの障害組織へのHoming効率を調べるために移入したヒト細胞を特異的に検出できるPrimerを用いたReal-time PCRによって細胞移入動物内での細胞動態を調べた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ラットのDNAからヒトDNAを特異的に検出するReal-Time PCRによって障害肝における歯髄MSC由来肝細胞の細胞生存曲線を明らかにする。
申請者らはラットDNAからヒトDNAを特異的に検出するGAPDHのPCR Primer配列を見出し、ラット組織中にヒトの細胞DNAを検出する系を確立している(論文投稿中)。これによってラットに移入したヒトの細胞の動態を定量的に知ることが可能になった。例えば正常ラット門脈内に投与した歯髄MSC由来肝細胞のラット肝内の量は、移入3時間で約1/100に減少することが分かった。この方法を用いて以下の点が明らかになった。
免疫不全ラットを用い歯髄MSC由来肝細胞の尾静脈経由投与と直接経門脈投与法を比較した結果、門脈投与では殆どの細胞が肝内に検出されたが、生存細胞は移入3時間で僅か100分の1に減少していた。一方尾静脈投与群では、ほとんどの細胞は肺にTrapされ、投与6時間後に肺で検出される細胞は移入量の10％程度であった。
一般的に組織障害が強い時に移入幹細胞の臓器特異的Homingが増強することが知られている。これを検証するため、D-galactosamineとConcanavalin A投与を行って作製した肝炎ラットにおける肝細胞障害の程度による歯髄MSC肝細胞の生存延長との関連性を明らかにすることを試みた。しかしながら、移入したMSCは障害肝や肺において、正常組織に比して長期に存在するという証拠を得られなかった。
以上本研究によってMSCの肝障害改善機序については、細胞の障害部位の生着による効果は乏しいことが示された。一定の知見が得られたという点で概ね順調に進展しているという自己評価をした。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究によって歯髄MSCによる肝炎抑制効果は、MSCの障害臓器への生着効果ではなく、MSCによって分泌される液性因子による免疫抑制効果によることが明らかになった。従って今後の研究で具体的な免疫学的機序を明らかにする。
具体的にはCytokine Antibody Arrayを用いたSecretome解析によって肝障害ヌードラットモデルにおいて変動するCytokine/Chemokineを網羅的に解析し、歯髄MSC由来肝細胞を門脈内に移入した場合と骨髄MSCを移入した場合を比較検討して特異的にUp, down-regulateされるCytokine/Chemokineを同定する。
近年ヒトの劇症肝炎においてIL-18が病態に重要な関与をすることが報告され、その抑制因子であるIL-18BPの臨床応用が検討されている(J Exp Med, 2019)。これは、特定のCytokineが重症肝炎病態のKey分子であることを示している点で重要である。これもふまえて更に1. これまでの研究でScreeningした血中Cytokine/Chemokineの結果に基づき、ラット肝組織から抽出したRNAを用い、定量RT-PCRによってその発現を検証していく。
2.肝障害ヌードラットモデルにおいて特定したCytokine/Chemokineに対する特異抗体でMSC培養上清からProtein G-Sepharoseによって当該蛋白を除去し、歯髄MSC由来肝細胞の門脈内移入との相乗効果を検証し、肝炎抑制の病態解明を完成させる。
3.研究分担者の石川による歯髄MSCの神経、骨、脂肪、膵β細胞の分化の研究成果と申請者の研究成果を突き合わせ、歯の細胞バンク統括責任者の中原とともにバンクの臨床応用に向けたメッセージを発信していく。
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| Causes of Carryover |
外注に依頼の検査結果・解析の結果が届いてから比較検討をするため実験に要する消耗品の購入が少なく繰越金が生じたが、今現在の実験は順調に進行しているため、本年度以降に実験に必要な試薬・消耗品を購入予定である。
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Research Products
(1 results)
