2020 Fiscal Year Research-status Report
マクロファージ由来骨再生因子の同定と歯槽骨再生医療への応用
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20K10022
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| Research Institution | Matsumoto Dental University |
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Principal Investigator |
中村 浩彰 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (50227930)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
堀部 寛治 松本歯科大学, 歯学部, 助教 (70733509)
雪田 聡 静岡大学, 教育学部, 准教授 (80401214)
原 弥革力 松本歯科大学, 歯学部, 助教 (90846635) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 抜歯窩治癒 / M2マクロファージ / 骨原生細胞 / 免疫組織化学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウスの上顎第一臼歯を抜去し、1日、3日、7日後に上顎骨を採取し、4％パラホルムアルデヒドで固定後、抜歯窩治癒過程を解析した。マイクロCTにて観察後、10％EDTAにて脱灰し、パラフィン切片を作製して免疫組織化学的に検討した。骨芽細胞系細胞のマーカーとして抗a-smooth muscle actin (a-SMA)抗体、抗Runx2抗体、抗Osterix抗体、マクロファージマーカーとして抗F4/80抗体、M2様マクロファージマーカーとして抗CD206抗体を用いてそれぞれの陽性細胞の分布を検索した。さらに、マクロファージ由来のサイトカインに注目して、TGF-b1局在およびTGF-bシグナルにより活性化されるリン酸化Smad-3局在についても検討した。
マイクロCT観察から抜歯3日後には抜歯窩に少量の不透過像がみられ、骨形成が開始していた。7日後には抜歯窩全体に骨形成を示す不透過像がみられた。骨芽細胞系細胞の細胞動態については、3日後には多くのa-SMA陽性細胞およびRunx2陽性細胞の侵入がみられた。7日後では骨形成が生じている領域にRunx2およびOsterix陽性骨芽細胞が多数認められた。マクロファージ系細胞の分布については、抜歯3日および7日後のいずれにおいてもF4/80陽性マクロファージが多数みられ、その一部はCD206を発現していた。また、CD206とTGF-b1に対する蛍光二重免疫染色により、CD206陽性M2様マクロファージはTGF-b1を産生することがわかった。さらに、a-SMA陽性細胞の一部の細胞の核内にリン酸化Smad-3が局在していたころから、骨芽細胞の分化にマクロファージ由来のTGF-b1が拘わっていることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
マウス臼歯の抜歯モデルにより、抜歯窩治癒過程の初期において多くのマクロファージが出現し、組織修復型マクロファージであるM2マクロファージに類似した、CD206陽性マクロファージがTGF-b1を分泌することが明らかにできた。また、予備実験的に抜歯窩組織からmRNAを回収してreal-time PCRにて解析したところ、TGF-b1発現が抜歯後に上昇していることがわかり、免疫組織化学による結果を支持する知見も得られている。さらに、CD206陽性M2様マクロファージの周囲のa-SMA陽性細胞の核内にリン酸化Smad-3局在がみられたことは、M2様マクロファージが分泌するTGF-b1が抜歯窩内の骨芽細胞分化に深く関わっていることを示唆している。この知見はこれまで報告がなく、新たな発見であり今後の骨再生治療においても多くの示唆を与えるものである。すなわち、マクロファージ由来骨再生因子の一つとして、TGF-b1の関与することが明らにできた。一方、骨折治癒時に出現するOsteomacのマーカーであるCD169陽性マクロファージは、抜歯窩治癒過程ではほとんど認められず、骨折治癒過程とは異なることがわかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
マクロファージを枯渇させるためにクロドロネート-リポソームを投与し、脾臓でマクロファージが枯渇していることを確認している。この実験系において、抜歯窩治癒過程をマイクロCTにて観察したところ、クロドロネート-リポソーム投与により抜歯窩治癒が阻害されていることを確かめている。今後、抜歯窩治癒過程を組織学的に観察し、F4/80およびCD206陽性マクロファージの分布について検討し、M2様マクロファージ由来のTGF-b1が拘わっているかについて解明する。また、組織から回収した遺伝子をreal-time PCR法により解析し、組織学的知見と比較検討する。さらに、抜歯窩治癒過程の初期においては、血管と未分化間葉系細胞の侵入が重要であるため、血管新生に拘わるサイトカインおよび間葉系幹細胞のマーカーであるPDGFレセプターに注目して解析する予定である。
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