口腔癌におけるangiogeninレセプターplexin-B2の発現と機能解析

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K10093
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 岸本 晃治 岡山大学, 歯学部, 客員研究員 (40243480)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 奥井 達雄 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 准教授 (40610928) ; 伊原木 聰一郎 岡山大学, 医歯薬学域, 准教授 (80549866)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: angiogenin / plexin-B2 / 口腔癌

Outline of Annual Research Achievements

(目的)Angiogenin(ANG)は、リボヌクレアーゼ活性を有する唯一の血管新生蛋白として発見されたが、内皮細胞のみならず癌細胞や神経細胞で細胞増殖、生存、再生能力などの様々な生物活性を有することがわかってきた。2017年に、ANGレセプターがplexin-B2(PLXNB2)であることが報告されて以来、癌や神経変性疾患におけるPLXNB2を介したANGの生物活性機序の解明が課題である。本研究では、口腔癌におけるPLXNB2の発現とANGをリガンドとするPLXNB2の機能解析を行うことにより、ANG-PLXNB2経路を標的とした新規口腔癌治療の可能性を明らかにする。
(実施計画)1. PLXNB2の発現が強い培養口腔癌細胞HSC-3を選択し、以下の実験を行う。2. PLXNB2 shRNAプラスミド DNA (Sigma 社)を使用し、LipofectamineTM 3000 Transfection Reagentを用いて遺伝子導入する。6well dishに70%コンフルエントの細胞を用意する。Mediumは6h前からDMEM，FBS(-)とする。PLXN：SIGMA MISSION shRNA Plasmid DNA TRCN0000300549。Control：SIGMA MISSION pLKO.1-puro Non-Mammalian shRNA Control Plasmid DNA。2日培養後、puromycinにてセレクションを行う。3. Stable shRNA transfectantを作製し、wild populationとして培養後、クローニングする。
(成果) 培養口腔癌細胞HSC-3に対して、PLXNB2 shRNAプラスミド DNA を遺伝子導入した。そして、stable shRNA transfectantを作製し、wild populationとして培養した。細胞を回収後、ウエスタンブロット法でPLXNB2の発現を調べたが、有意な低下は認められなかった。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

培養口腔癌細胞HSC-3に対して、PLXNB2 shRNAプラスミド DNA を遺伝子導入し、PLXNB2のノックダウンを試みたが、タンパクレベルでのPLXNB2の発現低下が認められず、その後の実験に進めなかったため。

Strategy for Future Research Activity

PLXNB2 stable shRNA transfectantの細胞を作製することが急務である。このため、PLXNB2 shRNAプラスミド DNAを、Sigma 社ではなく、他社のものも試してみる。また、遺伝子導入に、エレクトロポレーションも試してみる。

Causes of Carryover

PLXNB2のノックダウンを試みたが、タンパクレベルでのPLXNB2の発現低下が認められず、予定していた実験に進めなかったため、次年度使用が生じた。 使用計画としては、PLXNB2を、再度ノックダウンしANGへの影響を検討する実験 に必要な費用に充当する。