口腔癌におけるangiogeninレセプターplexin-B2の発現と機能解析

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K10093
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 岸本 晃治 岡山大学, 歯学部, 客員研究員 (40243480)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 奥井 達雄 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 准教授 (40610928) ; 伊原木 聰一郎 岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (80549866)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: angiogenin / plexin-B2 / 口腔癌 / A375細胞

Outline of Annual Research Achievements

(目的)Angiogenin(ANG)は、リボヌクレアーゼ活性を有する唯一の血管新生蛋白として発見されたが、内皮細胞のみならず癌細胞や神経細胞で細胞増殖、生存、再生能力などの様々な生物活性を有する。2017年に、ANGレセプターがplexin-B2(PLXNB2)であることが報告されて以来、癌や神経変性疾患におけるPLXNB2を介したANGの生物活性機序が注目されている。本研究では、口腔癌におけるPLXNB2の発現とANGをリガンドとするPLXNB2の機能解析を行うことにより、ANG-PLXNB2経路を標的とした新規口腔癌治療の可能性を明らかにする。
(実施計画)1. これまでPLXNB2の発現が強い培養口腔癌細胞HSC-3を使用していたが、計画通りPLXNB2のノックダウンを行うことができなかった。このため、ANGが細胞増殖に深く関与していると考えられるヒト悪性黒色腫A375培養細胞に変更して、さらに以下の実験を行った。2. PLXNB2 shRNAプラスミドDNA(Sigma社)を使用し、LipofectamineTM 3000 Transfection Reagentを用いて遺伝子導入した。PLXN:SIGMA MISSION shRNA Plasmid DNA。Control:SIGMA MISSION pLKO.1-puro Non-Mammalian shRNA Control Plasmid DNA。3. Puromycinでセレクション後、A375細胞のstable shRNA transfectantを作製した。
(成果) HSC-3細胞からヒト悪性黒色腫A375細胞に変更して、PLXNB2 shRNA プラスミド DNAを遺伝子導入した。そして、stable shRNA transfectantを作製した。細胞を回収後、ウエスタンブロット法でPLXNB2の発現を調べたが、有意と言える低下は認められなかった。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

HSC-3細胞に加えて、A375細胞についても、PLXNB2 shRNAプラスミド DNAを遺伝子導入し、PLXNB2のノックダウンを試みた。Puromycinでセレクションはできているものの、タンパクレベルでのPLXNB2の有意な発現低下が確認できず、その後の実験に進めなかったため。

Strategy for Future Research Activity

ANGが細胞増殖に深く関与している培養細胞において、PLXNB2 stable shRNA transfectantの細胞を作製することが、本研究を遂行する上で必要である。Puromycinでのセレクションはできているため、遺伝子導入試薬を変更し、導入効率を上げる。

Causes of Carryover

使用する細胞をHSC-3細胞に加えてA375細胞についても、これまでと同様の実験を行った。このため、これまで購入している試薬を使用し、新たな実験費用がかからなかったため、次年度使用が生じた。使用計画としては、遺伝子導入効率を上げるための、新たな遺伝子導入試薬購入と、ANGへの影響を検討する実験に必要な費用に充当する。