2020 Fiscal Year Research-status Report
亜鉛シグナルと顎骨炎症との関わり：亜鉛シグナルの制御に基づく新しい治療戦略の構築
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20K10101
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
佐藤 泰生 岩手医科大学, 歯学部, 講師 (40244941)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
入江 太朗 岩手医科大学, 歯学部, 教授 (00317570)
深田 俊幸 徳島文理大学, 薬学部, 教授 (70373363)
衣斐 美歩 岩手医科大学, 歯学部, 特任講師 (30609665)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 亜鉛シグナル / 亜鉛トランスポーター / Zip10 / コンディショナルマウス / 抜歯創 / 骨創治癒不全 / 形態計測 / 血管形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Zip10flox/flox-CreERT2マウスを用いた本実験を前提に予備実験を行った。
[抜歯創治癒における血管形成および骨形成の形態計測]
生後6週齢の野生型マウスおよび同週齢のZip10-EGFP-Ires-CreERT2マウスの上顎両側第一臼歯を全身麻酔下に抜去し，術後3,5,10日後に安楽死させ上顎骨を摘出した。バンドソーにて半割，PFA固定し10%EDTA脱灰後，未包埋の材料を振動刃ミクロトーム（VT1200S）にて200ミクロン厚に薄切し，Modified ScaleS 法による組織透明化とともに免疫染色（CD31, NG2）を行い，Keyence BZ-X710にてZスタック撮影し抜歯窩内の新生血管の三次元構築を観察した。また，10%EDTA脱灰後，通法に従いパラフィンに包埋，6ミクロン厚のパラフィン切片を作製した。HE染色，免疫染色（CD31, NG2）を行い抜歯創全体を含むデジタル画像を撮影し，撮影画像からImageJ1.53aおよびペンタブレット（XP-PEN）を用いて，抜歯創の占有面積(T)と創内の新生骨の占有面積(B)を測定し，各時点の骨形成率：新生骨面積(B)/創面積(T)を求め，各群間で比較した。また，血管内皮系マーカー（CD31, NG2）の発現・局在を指標に，各時点の創内血管内皮細胞（ないし周皮細胞）密度：血管内皮細胞（ないし周皮細胞）数/創面積(T)，あるいは，血管内皮細胞（ないし周皮細胞）数/[創面積(T)―新生骨面積(B)]を求め各群間で比較検討し亜鉛トランスポーター欠損による影響を検証した。以上より，今後の本実験での形態計測までの実験条件を決定することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Zip10floxedマウスの凍結精子からの個体復元ならびにZip10-EGFP-Ires-CreERT2マウスの帝王切開による微生物学的クリーニングに時間がかかり，やや進捗が遅れていたがほぼ完了の見込みである。今後は交配を進め実験群の確保と標本作製，Zip10発現細胞の追跡，Zip10欠損の影響について解析を早めて行く予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度の研究実施計画
①［実験動物の作製］亜鉛トランスポーターZip10 コンディショナルノックアウトマウス（Zip10floxedマウス）とZip10-EGFP-Ires-CreERT2マウスを交配せ,Zip10flox/flox-CreERT2マウスを作製する。［抜歯創の作製，検索材料の採取，病理組織学的解析］作製した６週齢Zip10flox/flox-CreERT2マウスにタモキシフェンを抜歯の２日前に投与した群と非投与群について，術後1,3,5,10,14日後に，各時点３匹ずつ（各群合計15匹）末梢血を採取後，安楽死させ上顎骨を摘出する。バンドソーにて正中で半割し，３匹のうち２匹では半割した片側をパラフィン包埋，組織切片を作製し病理組織学的に解析する。片側についてはフローサイトメトリー解析およびNGS 解析用に骨髄組織を採取し凍結保存する。残りの１匹は振動刃ミクロトーム（VT1200S）にて厚切り切片（200ミクロン厚）を作製し組織透明化（Modified ScaleS法）とともに免疫染色を行う。
②［多重蛍光免疫染色］各実験群から得られた組織切片およびModified ScaleS法により処理された透明化標本について，血管壁細胞，血管内皮系細胞，および骨髄由来間葉系幹細胞に特異的な一次抗体を用いて多重蛍光免疫染色を施し，亜鉛トランスポーター発現細胞の系譜と亜鉛トランスポーター欠損の影響を，血管形成および骨形成の推移と共に検証する。［形態計測］組織切片にて抜歯創全体を含むデジタル画像を撮影し，ImageJ1.53aおよびペンタブレット（XP-PEN）を用い血管形成ならびに骨形成について各群間で比較検討し亜鉛トランスポーター欠損による影響を検証する。
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| Causes of Carryover |
個体復元と微生物学的クリーニングに時間がかかり動物実験の実施にやや遅れが生じ，当初予定していた使用額を下回ったためである。次年度に繰り越し，翌年度分として請求した金額と合わせて実験を実施する予定である。
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Research Products
(4 results)
