口腔癌の新たなバイオマーカーとしてのエクソソームによる高感度診断法と治療法の開発

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K10126
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 篠塚 啓二 日本大学, 歯学部, 助教 (30431745)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 外木 守雄 日本大学, 歯学部, 教授 (50217519) ; 津田 啓方 日本大学, 歯学部, 准教授 (60325470) ; 市ノ川 義美 帝京大学, 医学部, 准教授 (20203101) [Withdrawn] ; 花上 伸明 帝京大学, 医学部, 准教授 (40385232) ; 小原 研心 大阪大学, 歯学部附属病院, 医員 (70598507)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 口腔癌 / エクソソーム / microRNA / バイオインフォマティクス

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、口腔癌の診断を目的として血清や唾液からエクソソームを濃縮し、RNAを回収して分泌型microRNA（miRNA）の網羅的な解析を行なう。その結果、病理組織でしか正確な評価ができなかった、口腔癌への分化の診断や血液マーカーや画像診断を組み合わせた口腔癌の診断に関しても、適切なmiRNAの発現パターンを用いることで正確な診断が可能であることを示す。さらに、miRNAと口腔癌関連遺伝子間に存在する、miRNAにより発現制御される遺伝子ネットワークを解明する。これらにより、細胞外へ放出されるエクソソーム含有miRNAの存在意義、エクソソームの役割を明らかにし、このエクソソーム含有miRNAをターゲットとした新たな癌治療戦略の開発を目指して研究を発展させることを目指している。
本研究に使用される試料は大きく分けて2種類、細胞株の上清（培地）と体液である。まずは、細胞株の培養上清を用いて解析を進めた。具体的には、口腔扁平上皮癌細胞株（HSC2，HSC-3，Ca9-22，Ho-1-N1）とヒト正常口腔粘膜細胞の培養上清液中に含まれるエクソソーム由来miRNAを抽出し，miRNAマイクロアレイを用いて，発現状態を網羅的に解析した結果，HNOKsと比較して，口腔扁平上皮癌細胞株4種類すべてについて，著明な発現変動を示し，口腔癌に関与していることが示唆される合計20種類のmiRNAを同定した。さらに同定したmiRNA 20種類に関して、その標的遺伝子について検索をした。選定したmiRNAとその標的遺伝子について、Ingenuity Pathway Analysis softwareを用いて、パスウェイ解析を行ったところ、6つのネットワークが形成され、その中で最もスコアが高く、同定したフォーカス遺伝子を有意に含むネットワークは、miR-125bを中心としたパスウェイが形成されていた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度の研究計画ではヒト口腔癌細胞株、臨床検体として口腔癌患者、口腔潜在的悪性疾患（白板症、扁平苔癬）患者、健常者の唾液及び血液を用いて、それぞれエクソソームを回収し、マイクロアレイ解析を行う予定であった。しかしながら、今年度もCOVID-19の影響により、患者からのサンプル採取は困難な状況にあることから、まずは、細胞株の培養上清液中に含まれるエクソソーム由来miRNAを抽出し，miRNAマイクロアレイを用いて，発現状態を網羅的に解析した。これにより、有用な結果を得られている。臨床検体を用いた研究は行える範囲で最終的に行う予定である。

Strategy for Future Research Activity

選び出された計20種類の分泌型miRNAについて、同定されたmiRNA が関与する、ターゲット遺伝子（mRNA）を検索し、選定したmiRNAとその標的遺伝子について、Ingenuity Pathway Analysis softwareを用いて、パスウェイ解析を行ったところ、6つのネットワークが形成され、その中で最もスコアが高く、同定したフォーカス遺伝子を有意に含むネットワークは、miR-125bを中心としたパスウェイが形成されていた。今後は、miR-125bを含む上流で制御している分泌型miRNAに注目し、以前に行われている、miRNAマイクロアレイおよびcDNA マイクロアレイによる総合的・網羅的な遺伝子発現プロファイリング・データーベースを活用し、比較解析を行うことで、発癌のメカニズムを明らかにする予定である。
さらに、今回得られた、パスウェイ解析をさらに進めていき、今回同定されたmiRNAとその標的遺伝子がどのような機能をもち、どのように発癌メカニズムに関与しているが、解析を行っていく。また、機能解析も併せて行う予定である。

Causes of Carryover

COVID-19の関係で患者サンプルの回収が行えずにおり、未使用額が生じてしまった。
繰越金と令和4年度の助成金を合わせて、パスウェイ解析ツールや細胞関連機器、エクソソーム・miRNAに関する機能解析に使用する試薬を購入予定である。