唾液腺幹細胞を用いた新規器官再生法の確立と臨床応用

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K10129
• Research Institution: Fukuoka Dental College
• Principal Investigator: 平木 昭光 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 教授 (60404034)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉本 尚平 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 講師 (70780188)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 唾液腺 / 再生 / 分化

Outline of Annual Research Achievements

本研究は成体マウスから唾液腺幹細胞を樹立し、これを幹細胞のソースとして器官再生や幹細胞移入を行い、生体の唾液腺再生法の構築と臨床応用を目指している。
2020年度は8週齢のC57BL/6Jマウスから顎下腺を摘出して細切し、プラスチックディッシュ上に付着させた後に低Ca（0.2mM）無血清 MCDB153/DMEM培地を加えて培養し、唾液腺幹細胞を分離した（分離細胞A）。その細胞はPan-CKとE-cadherin、CK-18、CK-19は陽性で、AQ5、Amylase、α-SMAは陰性であった。Ca濃度を上昇させることにより、Amylaseタンパク発現の上昇、AQ5の軽度上昇を認め唾液腺固有の機能が確認された。
2021年度は成体マウスから顎下腺を摘出し、1mm以下に細切した後にコラゲナーゼ typeIIとヒアルロニダーゼが入ったMEMで2時間処理を行った。回収した細胞をMatrigelTM-growth factor reduced で被覆したプラスチックプレート上でDMEM/F12にEGFやFGF10などの因子を加えた培養液にて培養し、オルガノイドの周囲に発生した細胞を分離した（分離細胞B）。その細胞の多くがp63に陽性を示し、αSMA陽性細胞が散見され、AQ5はほとんどが陰性を示した。このことより、この分離細胞群には多くの幹細胞や一部筋上皮細胞に分化した細胞が含まれている可能性が示唆された。
2022年度は分離細胞A、Bの分化誘導に際し、細胞外基質（フィブロネクチン、ラミニン、IV型コラーゲン）とHGFがどのような影響を及ぼすかを検討した。分離細胞AはIV型コラーゲン及びHGFの刺激によってAmylaseの増加が確認された。AQ5は明らかな増加は確認できなかった。分離細胞BではHGF刺激でAmylaseの増加が確認され、細胞外基質の影響は明確ではなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

2022年度の研究実施計画はやや遅れているものの予定通り遂行中である。今後、3次元分化誘導実験が進展しない場合、予備実験で唾液腺機能の獲得を確認済みであるオルガノイド組織を用いて同実験を行う予定である。

Strategy for Future Research Activity

分離細胞A、Bを用いた3次元器官再生：培養液は高Ca無血清 培地と霊長類ES/iPS細胞用培地、スキャフォールドは3％メチルセルロース培地とマトリゲルの2種類を使用する。最も誘導を促進する細胞外基質（IV型コラーゲン）で唾液腺幹細胞の混濁液を作成してスキャフォールド内に埋入し、誘導を促進する液性因子（HGF）を培養液に添加・刺激し、3次元に器官再生を誘導する。器官再生の評価項目は唾液腺の発生過程の再現（分枝の数、分泌顆粒の存在など）と、各種唾液腺マーカー（Amylase、AQ5、）の発現をタンパク、遺伝子レベルで発現を確認する。これらの実験で唾液腺機能獲得が確認できたら、セビメリン、ピロカルピン刺激による唾液排出機能に関して検索予定である。
もし、3次元分化誘導実験が進展しない場合、オルガノイド組織を用いて同実験を行う予定である。このオルガノイドは予備実験において、唾液腺の機能を一部獲得するなど分化誘導能があることを確認している。

Causes of Carryover

（理由）抗体等の試薬が納期に間に合わなかったため、次年度使用額が生じた。
（使用計画）今年度の研究計画において使用する予定である。