Analysis of cancer immune response using a virtual lymph node metastasis model

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K10141
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 熊丸 渉 九州大学, 大学病院, 講師 (90432947)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鬼丸 満穂 九州大学, 医学研究院, 助教 (00380626) ; 藤永 貴大 九州大学, 大学病院, 助教 (10738206) ; 鈴木 淳史 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (30415195)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: シングルセル樹立法 / 口腔扁平上皮癌細胞 / がんの不均一性・多様性

Outline of Annual Research Achievements

これまでに口腔癌細胞株WK2（70継代）でのヌードマウスの舌への異種移植では、造腫瘍能が30%（3/10頭）頸部リンパ節への転移能が33%（1/3頭）であり、また、同一患者の後発転移巣から樹立したWK3F癌細胞株では、造腫瘍能が50%（5/10匹）、頸部リンパ節への転移能が60%（3/5匹）であったことが確認されている。
がんの不均一性・多様性に対応しうる癌免疫応答を解明するうえで、さまざまなタイプのシングルセルの樹立は重要と考えられる。口腔扁平上皮癌細胞株（WK2）の初代培養より早期に保存された癌細胞より新しい方法でシングルセルの樹立を試みた。これまでの 1)通常の限界希釈法 2)シングルセル分注・培養プレートSmart Aliquotorを用いて方法では、辺縁からの増殖を厳密に除外するのが難しかった。そこで、24穴プレートの中央に1cell/50μlで滴下し、底面接着後にメディウムを加え、中央部の写真を定期的に撮影しながら、シングルセル由来であることを証明して、増殖したものをシングルセルとした。
600wellに播いた中で、シングルセル由来が25ｗell、1～2cell由来が15well、由来不明が30well、生着なし/継代可能な増殖なしが530wellであった。シングルセルの増殖した形態は、基底細胞様細胞、角化細胞様細胞、紡錘形様細胞に分けられ、増殖するにつれて混在していくwellもみられた。混在する細胞は、幹細胞由来のシングルセルであった可能性もあると考えられた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

これまでのやり方では厳密にシングルセルであることを証明することが困難であったため、時間と労力をかけて、中央のみに滴下し、写真で証明する方法(中央滴下型シングルセル樹立法)を考案した。また、離れた位置に2cellが生着していたら、片方の細胞を擦過除去して樹立率を高めた。これらのやり方を再現できるまでに時間を要した。

Strategy for Future Research Activity

細胞形態の異なるシングルセルの生物学的特性をMTT assay による増殖能、浮遊培養下でのSphere Forming Assay による自己複製能で調べ、GFP導入後にヌードマウスの舌への異種移植を行って転移能を確認する予定である。

Causes of Carryover

シングルセルの樹立に時間を要し、解析に要する予算までの使用に至らなかったため。今後は、増殖アッセイやGFP導入後の動物実験に研究費が必要である。