2020 Fiscal Year Research-status Report
Development of therapeutic agent for radiation salivary gland atrophy targeting the mechanism of differentiation of tissue-resident CD34-positive cells
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20K10142
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
井 隆司 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (30733448)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
住田 吉慶 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (50456654)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 放射線性唾液腺萎縮症 / 線維化 / CD34 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
頭頚部癌患者に対する放射線治療に併発する放射線性唾液腺萎縮症は患者のQOLを著しく低下させるが、その治療法は確立していない。またその典型的な病理像である線維化組織にみられる過剰な細胞外マトリックス(ECM)を産生する線維芽細胞の由来や、その活性化機序についての詳細は解明されていない。研究代表者は、これまでの研究により唾液腺に常在するCD34陽性細胞（Tissue Resident CD34positive cells; TR34）が放射線障害を受けた唾液腺組織において、血管障害による低酸素環境の刺激により、血管障害部に遊走・集積し、一部が周皮細胞（血管平滑筋/ペリサイト）に分化することで、障害早期には血管修復に寄与することを明らかにした。その後（照射後4週後）には、周皮細胞に分化せずに安定に存在していたTR34が、筋線維芽細胞への分化を開始し、過剰なECM産生を行い組織の線維化を促す現象の一端を見出した。本研究では、早期には血管修復に寄与するTR34が、組織環境の変化により過剰ECM産生を行う筋線維芽細胞へ分化・誘導する分子機序を解明することにより、線維化抑制に働く新規分子標的薬開発の可能性を検討することを目的としている。
初年度では、照射後4週を境にTR34を筋線維芽細胞へ分化誘導する要因の主体に着目し検討した。C57BL/6マウスの頭頚部のみに放射線照射（γ線；12Gy）した顎下腺を回収し（照射後1, 2, 4, 20週後）、低酸素関連マーカー（HIF-1α等）、炎症性関連マーカーを遺伝子発現を検討した。これによりTR34の筋線維芽細胞への分化時期との相関関係を評価した。またマウス顎下腺よりコラゲナーゼ法を用いてCD34陽性細胞（TR34）をFACSで分離した。続いて単離したTR34を間葉系幹細胞増殖・分化を可能とする培養条件（低グルコース含有DMEM）で、培養を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定通り、照射後4週を境にTR34を筋線維芽細胞へ分化誘導する要因の主体に着目し検討するために、頭頚部のみに放射線照射したC57BL/6マウスの顎下腺を回収し（照射後1, 2, 4, 20週後）、低酸素関連マーカー（HIF-1α等）、炎症性関連マーカーを遺伝子発現を検討している。これに加えて、繊維化関連マーカーについても複数種類実施している。これにより繊維化の起点となる時期を検討している。
またマウス顎下腺の組織よりコラゲナーゼ法によりTR34の回収を試みた。回収については作用させるコラゲナーゼの条件に従ってTR34の回収率・生死率等が左右されるため、その最も適当な条件を設定した。続いて単離したTR34を間葉系幹細胞増殖・分化を可能とする培養条件（低グルコース含有DMEM）の検討を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
C57BL/6マウス顎下腺組織において、放射線障害で誘導される線維組織を経時的にレーザーマイクロダイセクションにて回収し、サンプルよりmRNA・タンパク質を抽出する。これと併せて、培養下で繊維化誘導された筋線維芽細胞分化誘導前後の細胞サンプルからも同様にmRNA・タンパク質を回収する。これらサンプルを用いて、DNAマイクロアレイで炎症性関連遺伝子・低酸素関連遺伝子（HIF-1α等）や、そのカスケード下流にある線維芽細胞誘導関連遺伝子（CTGF、CXCR4、c-Met等）を網羅的に比較する。続いて遺伝子発現差異がみられた遺伝子について、個別にリアルタイムPCRの定量性解析と、ELISA法によるタンパク質の定量を行う。また併行して顎下腺組織においても、差異がみられたタンパク発現を免疫組織化学染色で確認する。これらより得られた遺伝子発現量・タンパク質の定量データよりTR34から筋線維芽細胞分化転換を誘導する分子・シグナル伝達系の検討を行う予定である。
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