2021 Fiscal Year Research-status Report
Mechanism of hypoxia-induced progression of malignant phenotype in oral cancers: Analysis by the 3-dimentional microenvironment model.
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20K10164
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
河野 憲司 大分大学, 医学部, 教授 (50214664)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
阿部 史佳 大分大学, 医学部, 助教 (00718421)
河野 辰行 大分大学, 医学部, 助教 (20548143)
川村 和弘 大分大学, 医学部, 客員研究員 (20815005)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 口腔扁平上皮癌 / 3次元微小環境モデル / 低酸素環境 / 悪性形質 / hypoxia-inducible factor / ErbBファミリー / 癌微小環境 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2020年度の口腔扁平上皮癌臨床症例の組織学的検索から、癌浸潤先端部の小型胞巣ではHIF1αの発現が強く、同部位ではしばしばEカドへリン減弱とNカドへリン発現が生じていたことから、低酸素環境により誘導されるHIF1αとカドへリンスイッチが関連するという仮説をたてた。この仮説に基づき、まずin vitroの低酸素環境で癌細胞の細胞接着が解除されるかを検討した。
当科で樹立した口腔扁平上皮癌細胞株MOK101とMOK201-10Eの2種類の細胞株を使用し、酸素濃度0.3％の低酸素状態で培養を行い、コロニーの形態変化（コロニーからのisolateする細胞の有無）を観察した。低酸素培養にはバイオニクス低酸素培養キットを用いた。MOK101はEカドへリン高発現細胞株で、細胞間接着が強く、正酸素濃度培養で辺縁の形態が平滑なコロニーを形成する。一方、MOK201-10EはMOK101と比べてEカドヘリン発現が弱く、コロニー辺縁がやや不規則である。まずMOK201-10Eを10cm径プレートで培養し、小コロニーが形成されたところで、低酸素環境に移した。培養7日後にコロニーからisolateする細胞を少数認めたが、この細胞はコロニー辺縁が不規則であるため、細胞のisolateが低酸素環境の効果かいなかの判断が困難であった。
次に、浮遊培養法により3000個の細胞から成る単一細胞集塊（single multicellular aggregate, single MCA）を作り、これらをプレート上に移し、単一コロニーが形成された後に低酸素環境に移して観察を行った。径日的に観察を続けたところ、10日頃からコロニー周辺にisolateする細胞の出現を認めた。この所見はMOK201-10EよりもMOK101で明瞭に捉えられた。
MOK101を用いて3次元培養での低酸素効果の検索をすすめている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
初年度（2020年度）に購入予定であったテーブルトップ冷却遠心機が、新型コロナウイルスパンデミックのため2021年度になった。この遠心機はsingle MCA形成のために必要であり、本研究課題の開始が遅れたことが理由のひとつである。
また当科で保存していたMOK201細胞のクローニング株の増殖が不良であったため、再度クローニングを行うなど、細胞の調製に時間を労した。
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| Strategy for Future Research Activity |
計画どおりに研究をすすめる。現時点で得られた結果から、通常の2次元培養で低酸素環境が細胞分散を起こすことが示されたので、次に3次元培養で同様の実験を行う。
併行して低酸素培養下のEカドへリン、Nカドへリン、HIF1a、ErbBファミリーのタンパク発現を蛍光抗体法とWestern blot法により検索する。
HIF1aノックダウン細胞の作成も同時進行ですすめる予定である。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルスパンデミックのため、2020年度に購入予定であったテーブルトップ冷却遠心機の設置が2021年度になり、2020年度と2021年度に予定していた実験が遅れたため、2021年度までの使用予定研究費の一部を2022年度に繰り越して、研究を行うことになったため。
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