2020 Fiscal Year Research-status Report
Hajdu-Cheney症候群特異的iPS細胞を用いた病態解明と治療法の開発
| Project/Area Number |
20K10170
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Dental College |
|---|
Principal Investigator |
間 奈津子 東京歯科大学, 歯学部, 講師 (90615379)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
東 俊文 東京歯科大学, 歯学部, 教授 (00222612)
中村 貴 東京歯科大学, 歯学部, 講師 (80431948)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | iPS細胞 / Hadju-Cheney症候群 / 骨芽細胞分化 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
Hajdu-Cheney症候群では、痛みや腫れを引き起こす炎症を伴った末端骨溶解症をしばしば認め、また圧迫骨折や変形などを含む脊椎異常や扁平頭蓋底などの進行性骨破壊、特に重度の骨粗鬆症が知られている。
進行性の骨破壊とそれに伴う深刻な骨粗鬆症や炎症を伴った骨溶解症を中心に、Hajdu-Cheney症候群の発症メカニズムを患者由来のiPS細胞から解明し、解明された病態に基づく新奇治療法の探索を行うために、2020年度はHadju-Cheney症候群患者から採血した単球細胞を単離後、iPS細胞作製し、iPS細胞用コロニーを得た。さらに、得られたhadju-Cheneyy症候群患者細胞由来iPS細胞（HC-iPS）を基に、骨芽細胞分化誘導実験を進めた。骨芽細胞分化誘導に関しては、我々の研究室が開発した誘導方法（PLoS One. 2014;9(6):e99534.）を用いて行った。iPS細胞を非接着性培養皿で培養しEB体を作製、Trypsin-EDTAで単細胞化しコラーゲンコ‐トした培養皿上に播種。 FGF2、TGF-β、IGFを含む骨芽細胞誘導培地で14日分化誘導を行った。
骨芽細胞分化誘導を行った細胞を骨芽細胞分化マーカーであるBSP、Dlx5、Sp7、Bglapなどを用いて、RealTime PCRにより遺伝子発現を測定した。さらに、ALP酵素活性をpNPPを基質して染色し、石灰化についてはvon Kossa染色にて検討を進めている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2020年度の研究予定として、Hadju-Cheney症候群患者由来のiPS細胞を単離し、培養する。さらに、イントロン33にLeft armとRight arm とExon34以降のcDNA+stop codonをTarget vectorとし、Crisper Cas9法を利用することで遺伝子変異を正常化したRev iPS細胞を作成する。Rev iPS細胞の樹立を確認後、骨芽細胞分化誘導実験を行い評価することを挙げている。
現在の進歩状況として、Hadju-Cheney症候群患者から採血した単球細胞を単離後、iPS細胞作製し、iPS細胞用コロニーを得た。さらに、得られたhadju-Cheneyy症候群患者細胞由来iPS細胞（HC-iPS）を基に、骨芽細胞分化誘導実験を進めた。
骨芽細胞分化誘導を行った細胞を骨芽細胞分化マーカーであるBSP、Dlx5、Sp7、Bglapなどを用いて、RealTime PCRにより遺伝子発現を測定した。さらに、ALP酵素活性をpNPPを基質して染色し、石灰化についてはvon Kossa染色にて検討を進めている。そのため、Rev iPS細胞作製以外ではおおむね順調に進展している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
2021年度の実験予定では、Hadju-Cheney症候群患者細胞由来iPS細胞から破骨細胞へ分化誘導を行う。
iPS細胞からまずは、単球を作成し、フローサイトメトリーを用いて単球であるかを確認後、破骨細胞を誘導しTRAP染色やPitFormationアッセイにより評価を行う。さらに、Notch2,Hes1 および 炎症性サイトカイン（TNFα,IL6,IL1b、NFkB） Nfatc1発現をreal-time PCR法により測定、Jag1発現をReal-time PCR法で測定し、免疫ブロッティング法によりJAG1,NOTCH2,N2ICD,HES1,NFATｃ１蛋白量を検出する。
|
| Causes of Carryover |
会計の決済が間に合わなかったため。次年度の計画である破骨細胞分化誘導に用いる試薬に使用する予定である。
|
