2021 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the prevention mechanism of dental caries in children by the TAS2R family of bitter taste receptors
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20K10203
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
香西 克之 広島大学, 医系科学研究科(歯), 名誉教授 (10178212)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩本 優子 広島大学, 医系科学研究科(歯), 助教 (00748923)
光畑 智恵子 広島大学, 医系科学研究科(歯), 准教授 (10335664)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 小児う蝕 / ヒト苦味受容体 / TAS2R 遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
齲蝕発症には齲蝕原因菌，食物中のショ糖およびホストである歯の耐酸性，さらには時間因子（習慣）の多因子が関わっている。そのため齲蝕予防は以前より各因子に基づいた対策が行われてきたが，多様な生活環境を科学的に制御することは難しく，未だに齲蝕をゼロにすることはできていない。
苦味受容体は口腔内で味覚をつかさどる受容体の１つであるが、口腔以外の器官にも存在し、免疫に関与していることが報告されている。齲蝕発症の新規抑制因子として苦味受容体をターゲットとし、味覚発達期にある小児を対象として苦味受容体の分布量や変異と齲蝕発症動態について明らかにし、齲蝕抑制への関与とそのメカニズムについて明らかにすることを目的としている。苦味受容体は苦味物質の認識を行うと同時に、齲蝕原因菌などの口腔内の感染に対する防御機構が機能することが期待される。
令和３年度の研究計画はコロナ禍により変更を余儀なくされ，令和４年度に多くの実験を持ち越すこととなった。
令和３年度は，低年齢重症齲蝕児の苦味受容体の変異解析を行うために当診療室を受診した低年齢（5歳未満）の重症齲蝕児と主養育者ならびに同年齢で齲蝕のない患児とその主養育者の口腔より粘膜細胞を採取し、ゲノムDNAを準備したのち、次世代シークエンサーを用いて25種類のTAS2Rについてシークエンス解析を行う予定であったが，診療制限で対象が十分集まっておらずデータ解析に至っていない。一方、マウスを用いて水と砂糖水とで飼育を行い、両群における舌上の苦味受容体の発現量について解析を行う準備を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
新型コロナウイルス感染拡大の中で，研究代表者がR３年３月で定年退職し学外からの研究室への出入が制限される期間が続き，予定していた退職後の研究体制が計画通りに遂行できなくなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
実験1． 低年齢重症齲蝕児と両親(養育者)の苦味受容体の変異解析: 低年齢(5歳未満)の重症齲蝕児10名と養育者ならびに同年齢で齲蝕の ない患児10名とその家族の口腔粘膜より粘膜細胞を採取し，NucleoSpin DNA Forensic(タカラバイオ(株))を用いてゲノムDNAを抽出・精製 し，次世代シークエンサーを用いて苦味受容体の変異の解析を行う。
実験2． 変異苦味受容体変異体の in vitro での解析: 変異(＋)の患児の唾液からRNAを回収し，ター ゲット遺伝子のcDNAを構築したのち，哺乳類細胞での発現ベクターを作製する。HEK293細胞に一過性にコンストラクトを発現させ，苦味物質を添加することでの細胞応答として、細胞内のカルシウムの動向，一酸化窒素の萌出、ディフェンシンの放出等を比較検討する。
実験3． 実験動物を用いた味覚受容体の量的変動解析: 妊娠マウスを2グループに分けて妊娠期より水(W群)、砂糖水(S群)で 飼育する。 実験3-1 : 苦味受容体の発現量を解析:仔マウスを離乳後，2グル―プに分け， 水(WW群・SW群)，砂糖水(WS群・SS群)で飼育を行う。舌組織よりゲノム・RNAを抽出し、苦味受容体の発現量を解析する 実験3-2： 苦味受容体の発現量とその変化を解析:飼育中に砂糖水から水に変更し，その後、全身的な変化ならびに舌組織よりゲノム・RNAを抽出・精製し，苦味受容体の発現量とその変化を解析する。 実験3-3： 免疫応答と苦味受容体の発現量の変化:上記条件での飼育したマウスに対し免疫応答を高めた後 脾臓を取り出し，各種サイトカインの測定を行い，それぞれの群間を比較検討する。
すべてのデータをまとめ，齲蝕感受性の有無による苦味受容体 TAS2R 遺伝子の発現量と齲蝕抑制との関係と分子メカニズムを明らかにする。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染拡大の中で，研究代表者が令和３年３月で定年退職し学外からの研究室への出入が制限される期間が続き，予定していた退職後の研究体制が計画通りに推敲できなくなった。
令和４年度では，令和３年度未執行の予算も含めて使い，遅れている実験を急ぎ実施する。予算はほとんど消耗物品費に充てることになるが，具体的には，マウス及び飼料，ゲノム抽出，RNA解析などの分子生物学的実験用試薬およびディスポ器具，次世代シークエンサーのための試薬購入に充てる。また学会出張が可能となれば研究発表や研究打合せ旅費に充てることとする。
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