2022 Fiscal Year Annual Research Report

Identification of Patogenic Bacteria in Aspiration Pneumonia by LAMP Method

Research Project

Project/Area Number	20K10214
Research Institution	Meikai University
Principal Investigator	星野倫範明海大学, 歯学部, 教授 (00359960)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	荻原孝明海大学, 歯学部, 講師 (10705247) 大岡貴史明海大学, 歯学部, 教授 (30453632)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	LAMP法 / 誤嚥性肺炎 / Prevotella属 / Porphyromonas属 / アライメント解析 / 遺伝系統解析 / グラム陰性嫌気性桿菌
Outline of Annual Research Achievements	本研究ではまず、誤嚥性肺炎の起炎菌であるPrevotella melaninogenicaを含むPrevotella属の菌種と近縁の歯周炎などの口腔疾患の原因菌となるPorphyromonas属の菌種をLoop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）法により検出同定する方法を確立することとした。また、これらの細菌属は病原遺伝子の一つとしてType IX secretion systemコードする遺伝子群を有する。そこで我々は、これらの遺伝子群のうち、porK遺伝子に着目してLAMP法用のプライマーを作成した。 DNAデータベースよりporK遺伝子を有する菌種を抽出したところ、Prevotella属よりPrevotella melaninogenicaをはじめとした3菌種が、Porphyromonas属より、Porphyromonas gingivalisをはじめとした2菌種がピックアップされ、さらにPorphyromonas gingivalisでは、3菌株で同遺伝子が確認された。アライメント解析により、Porphyromonas gingivalisでは同一菌種内での相同性は99％以上で、菌種内では保存されていることが示唆された。その一方で、菌種間では一定の相同性は認められるものの、多様性があり、菌種特異的なプライマーの作成可能な領域であることが示された。遺伝系統解析では、Prevotella属、Porphyromonas属でそれぞれ２つのクラスターが形成され、Prevotella属からみた場合、Porphyromonas gingivalisと近縁関係にあった。 LAMPプライマーをこれら5菌種に対して設計し、各々精製ゲノムDNAを鋳型としたＬＡＭＰ法を行ったところ、菌種特異的に陽性反応を示し、in vitroの系ではこれらの菌種を同定するのに有効でることが示された。その一方で、ヒトの唾液を検体としたＬＡＭＰ法では安定した結果を得られなかった。その原因は、使用した検体中に対象となる菌種が存在しない、あるいは存在しても量が少なく検出することができないということが考えられ、今後はサンプルの濃縮方法、検出感度の向上など検討する必要があると考えられた。