2020 Fiscal Year Research-status Report

口腔扁平上皮癌における擦過細胞および5-ALAを用いた光線力学的診断法の確立

Research Project

Project/Area Number	20K10256
Research Institution	Nihon University
Principal Investigator	福本雅彦日本大学, 松戸歯学部, 教授 (50175569)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	PDD / 口腔扁平上皮癌 / 蛍光プレートリーダー
Outline of Annual Research Achievements	ヒト口腔癌由来扁平上皮癌細胞株を用いて細胞内に5-aminolevulinic acid(以下、5-ALA）を取り込み、PpⅨを蓄積させ励起波長405mにて励起光を照射し630nm波長帯にて蛍光が確認すると共に5-ALAの最適濃度を検討した。ヒト口腔癌由来扁平上皮癌細胞株であるHSC-2、HSC-3、HSC-4、Sa-3および対照群としてヒト正常口腔粘膜細胞株（NHOK）を実験に供した。細胞株は直径10㎝のディッシュ上で非動化済10％ウシ胎児血清および2％ペニシリン添加Doulbeccos Modified Eagles Medium（DMEM）を用いて5％CO2下37℃で培養した。80％コンフルエンスを目途に継代した。培養細胞をPBSにて2度洗浄後、Trypsin EDTAを2分間作用しディッシュより剥離し遠心分離（1000rpm×5min）を行い細胞回収した。回収した各細胞株を蛍光用96wellプレートに1×103～5/wellとなるよう、それぞれ播種し5-ALAを作用させ細胞により代謝され生じるプロトポルフィリンⅨ（PpIⅨ）に対して蛍光プレートリーダーを用いて400～440nmの励起波長により蛍光する630nm波長帯の蛍光強度を経時的に測定した。また、蛍光強度を増強する目的でdeferoxamine mesylate（DFO）の添加を試みる準備実験としてDFOの毒性試験を実施した。その方法として回収した細胞にDFO 5μmol、50μmol、500μmol、5mmol各濃度を作用させ細胞生存を確認した。その結果いずれの濃度においても細胞毒性は認められなかった。この研究から得られた結果により、5-ALAを生体へ投与することなく生体為害性を完全に排除した状況で口腔癌診断を確実に実施できる可能性が現実化した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 正常口腔粘膜細胞の対照群と比較していずれの口腔扁平上皮株も有意に高い蛍光強度を示した。また、5-ALAの最適濃度は2mmolであった。 deferoxamine mesylate（DFO）の毒性試験のため回収した細胞にDFO 5μmol、50μmol、500μmol、5mmol各濃度を作用させ細胞生存を確認した。その結果いずれの濃度においても細胞毒性は認められなかった。
Strategy for Future Research Activity	今後、最適の蛍光強度を得るためには、どのくらいの細胞数を5-ALAに作用させるのが有効かを検討する。具体的には蛍光用96wellの1well内の細胞量を１×10の3乗個、1×10の4乗個、1×10の5乗個、1×10の6乗個、1×10の7乗個に調整し最適の蛍光強度を最小の細胞数で得られる条件を探る。また、5-ALA に既に毒性試験により細胞毒性が無いことを確認したdeferoxamine mesylate（DFO）を5-ALA添加し、DFO添加5-ALAと5-ALAのみ作用させた場合の蛍光強度を比較しDFO添加の有効性を確認する。またDFO添加5-ALAと5-ALAのみの蛍光強度を経時的（1～700分）に測定することにより最適計測時間を判定する。以上のことを実施し診断に有効な蛍光強度を得るための最適条件を確認する。
Causes of Carryover	蛍光強度測定用のマイクロプレートリーダーは当初、市販の機器を購入予定であった。しかし機器製作業者と本実験の目的に沿った機器の作製が可能か協議した結果、市販のものより、一層コンパクトかつ安価な機器を作成可能であることが判明した。そのため市販品購入予定のものをオーダー作成に切り替えた。これにより次年度使用額が生じた。今年度に得られたデータと次年度予定している実験結果を解析する際の作業量が多く比較的高性能のPCや解析・統計ソフトを使用する必要がある。そのため次年度にこれらの機器の購入に今年度の繰越金を充てる予定である。