2020 Fiscal Year Research-status Report
「複数菌の病原性を抑えて混合感染症を制御する」に向けた試み
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20K10270
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
西口 美由季 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (10253676)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鵜飼 孝 長崎大学, 病院(歯学系), 教授 (20295091)
近藤 好夫 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (30581954)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ９型分泌装置 / P.melaninogenica / 歯周病 / 口腔常在菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Prevotella melaninogenica Prevotella melaninogenica は誤嚥性肺炎に関連する口腔常在細菌で、 新生児から高齢者まで検出される。P. melaninogenica は口腔感染症の検体から多く分離されるとともに、婦人科領域感染症の原因菌ともなる。これまで P. melaninogenica の病原因子分泌機構（９型分泌装置）の解析を行ってきた。P. melaninogenica の９型分泌装置の変異株は赤血球凝集能、動物実験での病原性が著しく低下しており、本菌の９型分泌装置と病原性との関係性が示唆された。口腔内にはP. melaninogenica と同じくバクテロイデーテス門に属し、９型分泌装置を用いて病原性を発揮していると考えられる菌種が多く存在する。Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia 等の主に歯周病細菌で報告される。これらの細菌も含めて、９型分泌装置が口腔疾患（主に歯周病）に関与しているのか、また分泌装置の機能抑制でもって病原性の制御は可能なのか、歯周病動物モデルを用いて検証することが研究目的である。
このため細菌の分泌装置の病原性への関与を検証するために、歯周病菌の９型分泌装置変異株および９型分泌装置機能抑制候補化合物を揃え、マウス歯周病モデルでの感染実験を行う計画とした。
本年度は、口腔細菌の野生株、９型分泌装置変異株を用いた検証を行うために、歯周病感染マウスモデルの構築を始めた。まず、マウスにP. gingivalis を単独で感染させ、顎骨を含めた歯周組織の切り出し、歯槽骨吸収の計測、包埋、病理切片の作製までの一通りの実験をおこなった。また、歯周病関連細菌を含めた感染マウスモデルの構築のために、同じPrevotella 属である、Prevotella nigrescensについて、標準株および口腔分離株を用いて、９型分泌装置の構成分子遺伝子変異株の作製を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
① 「９型分泌装置変異株の準備」北海道医療大学から分与していただいた、Prevotella nigrescens 26株に対して、９型分泌装置構成分子の変異株作成を電気穿孔について２回、接合伝達を用いて３回ずつ試みた。１株から１回、薬剤カセットをゲノム上にコードする株が得られたが、目的遺伝子と入れ替わっておらず、９型分泌装置構成分子変異株は得られなかった。この１菌株について、ゲノム解読を行っている。
② 「化合物による分泌装置の制御」長崎大学天然抽出物・化合物を用いて、主要な歯周病菌であるPorphyromonas gingivalis に対する９型分泌装置の機能抑制候補化合物を得ている。これについて、再度、候補化合物を分与していただき、再試験を行ない、再現性の確認をおこなった。再試験の結果から、再現性のないものを外し、候補を絞った。
③ 「歯周病混合感染マウスモデルの構築」歯周病感染マウスモデルの構築を始めた。まず、マウスにP. gingivalis の野生株と９型分泌装置欠損株を、それぞれ単独で感染させ、顎骨を含めた歯周組織の切り出し、歯槽骨の計測、包埋、病理切片の作製までの一通りの実験を行なっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
「歯周病混合感染マウスモデル」モデル構築をめざして、まずは、P. gingivalis の野生株と９型分泌装置変異株をそれぞれ単独でマウスに感染させている。モデルにおける歯周病の指標となる数値や炎症マーカーの検出を確認するため、歯周組織の歯槽骨の吸収を測定し、組織切片を作製する。CD4、CD8に対して免疫組織染色し、炎症像のある組織で免疫担当細胞の存在を確認する。
混合感染マウスモデルの構築のために、Prevotella nigrescensの９型分泌装置構成分子の変異株取得の試みを続ける。新たな口腔分離菌株の収集と、遺伝子操作による変異株作製を試みる。
「化合物による分泌装置の制御」長崎大学天然抽出物・化合物を用いて、歯周病菌Porphyromonas gingivalis に対する、化合物スクリーニングを引き続き行う。９型分泌装置の機能を抑制する可能性のある、候補化合物が複数得られている。ある程度の数に絞られたところで、候補化合物の構造から、すでに登録されている抗生剤やその類似体を省いていく。また、候補天然抽出物に対しては、９型分泌装置の機能抑制試験を繰り返し行い、候補分子の単離精製を目指す。
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| Causes of Carryover |
昨年度、新型コロナ感染症のため「歯周病混合感染マウスモデルの構築」に向けた、マウス感染実験のプレ実験を開始する時期に遅れが生じた。そのため、計画していた感染実験のための設備使用料、消耗品等を次年度使用とした。
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