2021 Fiscal Year Research-status Report
Development of oral biofilm-associated disease preventive agent targeting vesicle complex
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20K10286
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
泉福 英信 日本大学, 松戸歯学部, 教授 (20250186)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 紀弘 宇都宮大学, 工学部, 教授 (00261818)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | バイオフィルム / Streptococcus mutans / クロロゲン酸 / リン酸カルシウム / Staphylococcus aureus / renG組み換えS. mutans / フノラン / ルシフェラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
口腔バイオフィルム(BF)は、多くの微生物が歯表面において集合体を作り、微生物が生き永らえられるために形成された生物学的付着物である。近年、菌体から放出される細胞外DNAおよび細胞外RNAと膜小胞（べジクル）が複合体を形成し、この複合体が様々な口腔微生物のバイオフィルム形成に寄与していることが明らかにされた。そこで本研究では、このベジクルをターゲットにして、ベジクル依存的BF形成を阻害する物質の検討を行った。最終的に関連疾患の予防方法を総合的に開発することを目的にしている。今回使用した抑制物質の候補は、キシリトール、フノラン、クロロゲン酸、アパメド、銀イオン、DNase Iなどである。う蝕原因菌であるStreptococcus mutans、日和見菌のStaohylococcus aureus、S. mutansとS. aureusの混合BF、ベジクル依存的S. aureusのBFに対する候補抑制物質の効果を検討した。その結果、キシリトールとフノランを混合すると、ベジクル依存的S. mutans BF形成を阻害することが明らかとなった。クロロゲン酸は菌体の増殖を抑制することでBF形成を抑制した。昨年抑制効果が確認された銀イオンとアパメドの併用は、銀イオンの効果で死菌体バイオフィルムが形成される。それをリン酸カルシウムであるアパメドでそのBFを除去するという抑制メカニズムが明らかになった。0.125MNaClによりS. aureus BFが形成され、さらに0.25MNaClでS. aureusとS. mutansの混合BFが形成された。そのBFはDNase Iにより完全に抑制された。これらのように、抑制物質は様々な条件のベジクル複合体によるBFを抑制することが明らかとなった。よって、抑制物質の使用の仕方を組み合わせることで効率のよいBF抑制方法が確立できることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
膜小胞（べジクル）複合体に依存的な単独菌（S. mutans)および複合菌（S. mutans+S. aureus)のBF形成に対して、昨年度検討した抑制物質に加えて新たに様々な候補物質を試した中で、キシリトールとフノランの混合、クロロゲン酸、DNase Iに抑制効果が認められた。昨年明らかになったリン酸カルシウムの抑制効果が銀イオンにより誘導された死菌体によるBF形成を抑制していたことから、抑制メカニズムが明らかになった。これらの結果は、本研究の目的であるベジクル依存的バイオフィルム形成抑制物質を明らかにすることと、抑制物質を利用した関連疾患予防方法の確立に重要な情報を与えるものである。よって、これらの研究結果は、本研究が順調に進展していることを示している。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度であることから、計画していたべジクル複合体を化学的に阻害する低分子化合物を探索し、BF形成を阻害する化合物を明らかにする。国内最大規模の化合物ライブラリーを保有する東京大学創薬機構と連携し、信頼度の高いスクリーニング系を構築する。べジクル複合体を用いたS. mutans, Streptococcus gordonii, Fusobacterium nucleatum, Actinomyces naeslundii, Staphylococcus aureusのBF形成をターゲットとして50000 化合物のスクリーニングを行い、ベジクル複合体を分解してBF形成を選択的に阻害する化合物を取得する。一次スクリーニングは、プレートを用いてBF形成実験を行い、20～50を目安として抑制化合物を取得する。さらに大気圧走査電子顕微鏡(ASEM)による解析技術を用いて、べジクル複合体が分解されるか観察する。ASEMは、乾燥させずに溶液中で観察することができ、これはBFを観察する上で極めて重要である。新しい抑制物質のin vitroにおける上皮細胞株や繊維芽細胞株への障害性の検討およびマウス口腔内投与による口腔常在菌叢の変化を検討する。抑制物質の抑制メカニズムを考慮して、組み合わせによる関連疾患の予防方法を確立する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナ感染症の影響で、参加を予定していた複数の学会に参加できなくなり、旅費を使用する事ができなかった。また、同様の理由で実験補助員を雇い実験させることもできなかった。化合物ライブラリーを用いた検討を次年度に行うことにしたため、これらを総合して次年度使用額が生じることとなった。令和4年度は、研究をまとめることを念頭において、化合物ライブラリーを用いたバイオフィルム形成阻害実験において消耗品費に充てる。また、集中して研究を行い、成果をあげて論文にまとめ、英文校正費や雑誌掲載費などに充てる。これらのように、研究費を適切に使用していくことを計画している。
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