2020 Fiscal Year Research-status Report
指定難病であるクローン病発症・増悪に関与するKlebsiellaの感染経路の特定
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20K10300
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
續橋 治 日本大学, 松戸歯学部, 准教授 (80333110)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | Klebsiella pnuemoniae / 口腔細菌叢 / クローン病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和2年度は、唾液などのヒト口腔試料を対象としたKlebsiella菌選択培地の開発とその有用性の検討を行った。まず、ヒトから得られた唾液などの口腔試料を用いるため、日本大学松戸歯学部の倫理審査委員会に本研究の申請を行い、承認を得た。承認後に唾液などの口腔試料を対象としたKlebsiella菌選択培地の開発を行った。既存のKlebsiella菌選択培地に、ヒト唾液試料を接種・培養後、選択培地上に発育したピロリ菌以外の口腔細菌を目的外菌とし、分離操作を行い、その分離菌株の純培養と菌株のストックを行った。当研究室で保有しているKlebsiella菌認定株7株を用いて、最もKlebsiella菌の発育に適した基礎培地の検討を行った。その結果、普通寒天培地にKlebsiella菌が良好な発育を示したために、これをKlebsiella菌選択培地の基礎培地とした。分離した目的外菌の複数株とKlebsiella菌認定株の7株に対して、抗菌薬ディスクを用いた薬剤感受性試験を実施した。それにより、目的とするKlebsiella菌の発育を阻害せず、かつ目的外菌のみの発育を阻害する抗菌薬の選定を行った結果、ペニシリン、バシトラシン、リンコマイシン、アムホテリシンBを選んだ。また、Klebsiella属菌の中でKlebsiella pnuemoniaeは特異的に乳糖を分解して酸を産生する能力を有するために、培地中に乳糖とpH指示薬であるフェノールレッドを添加することにより、Klebsiella pnuemoniaeの集落を選択的に黄色化させるように工夫を凝らした。以上の試薬で構成された選択培地を作製して、3名から採取されたヒト唾液試料をその培地に接種・培養後、実際の臨床で本選択培地が有用であるか否かを検討した。本選択培地は、目的とするKlebsiella菌以外の口腔細菌の発育を著しく抑制した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Klebsiella菌の発育・培養に関しては、事前に文献等の調査および予備実験を行っていたために、研究に供するピロリ菌の培養特に問題なく行うことが可能であった。また抗菌薬感受性試験を行った結果、ピロリ菌が感受性を示さず、代表的な口腔細菌が感受性を示す抗菌薬を複数見つけることが出来たことで、スムーズに唾液等の口腔試料を対象としたピロリ菌を分離・検出するための選択培地の開発はスムーズに行うことが可能であった。さらには、申請者らはこれまでにAggregatatibacter actinomycetemcomitans、Corynebacterium matruchotii、Microbacterium属菌、Rothia dentocariosa、Rothia mucilaginosa、Rothia aeriaなどといった病原性をもった口腔細菌を分離・検出するための複数の選択培地を開発した経験があり、これらのことも本研究課題が概ね順調に進展している理由として挙げられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究協力に同意が得られた被験者200名（予定）から採取した唾液試料を適当な濃度へ段階希釈し、前年度に開発した選択培地へ接種し、当研究室に設置されているインキュベーターにて培養を行う。総菌数に対する比率も算定するために総菌用培地にも同様に唾液試料を適当な濃度へ段階希釈し、接種・培養を行う。総菌用培地にはCDC羊血液平板培地を用いる予定である。総菌用培地は、当研究室に設置されている嫌気培養装置を用いた嫌気培養を行う。培養後に、培地上に形成された集落数から集落形成単位（CFU）を算定することにより菌数算定を行う。この結果により、口腔におけるKlebsiella菌保菌者率、唾液中の総菌数に対するKlebsiella菌の比率を求める。これにより、ヒト口腔内におけるKlebsiella菌の分布を調査する。また年齢別などのKlebsiella菌保菌者率の違いなどの検討も行う予定である。菌種同定は、Klebsiella菌特異的プライマーを設計し、PCR法によって行う予定である。
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