2020 Fiscal Year Research-status Report
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20K10435
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| Research Institution | Dokkyo Medical University |
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Principal Investigator |
藤田 博美 獨協医科大学, 医学部, 特任教授 (60142931)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
若尾 宏 獨協医科大学, 医学部, 教授 (10280950)
杉本 智恵 獨協医科大学, 医学部, 准教授 (60469955)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | MAIT細胞 / NK細胞 / 抗がん作用 / 生存期間延長 / 肺がん / iPS細胞 / 分化誘導 / 養子移入 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Mucosal-associated invariant T (MAIT)細胞は自然免疫と適応免疫とを橋渡しする自然免疫型T細胞に属する、ヒト最大のT細胞亜集団を形成する。MAIT細胞はがん患者の腫瘍部位に集積、あるいは末梢血中から消失するなど、がん病態と深い関わりが示唆されているが、その実態は不明であった。我々はiPS細胞を用いた細胞工学的アプローチを用いて、従来にない新規マウスモデルを創生し、MAIT細胞が抗がん作用を発揮することを明らかにしてきた。これまでにマウスMAIT細胞を初期化してiPS細胞を作製し、ここからMAIT様細胞(以下、m-reMIAT細胞)へと分化誘導することに成功した。m-reMAIT細胞を同種マウスに予め養子移入すると肺がん細胞を移植したマウスの生存期間を延長させる。そこで、今年度はm-reMAIT細胞による抗がん作用の機序解明を行なった。自然免疫リンパ球であるNK細胞はがん監視の最前線で働いている免疫細胞である。今回、m-reMAIT細胞による抗がん作用はNK細胞を介していることを明らかにした。予めm-reMAIT細胞を移入したマウスを２つの群にわけ、片方にはNK細胞をマウス体内から除去する抗体Anti-asialo GM1 (AGM1)を投入、もう片方は処置なしで、肺がん細胞を移植して、生存期間を測定した。その結果、AGM1処置群（NK細胞が除去されている）では未処置に比して有意に生存期間低下がみられた。この結果からm-reMAIT細胞はNK細胞を介して抗がん作用を発揮することが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績で記載した様に今年度はm-reMAIT細胞がNK細胞を介して抗がん作用を発揮することを明らかにした。この点につき、以下に説明する。m-reMAIT細胞を６日前に養子移入した、あるいは未処置のC57BL/6マウスに肺がん細胞(LLC)を移植する前日、翌日、１２日後の３回、AGM1抗体（50 マイクログラム/マウス）を腹腔内投与して体内からNK細胞を除去した。この時、コントロールとしてAGM1抗体を投入しないマウス群を用いた。NK細胞が体内から除去されていることは末梢血CD45+細胞中のCD49d+NK1.1+細胞 (NK細胞)がAGM1抗体投与によって消失していることをがん移植前日、移植後１０、２０日でフローサイトメータにて測定し、これを確認した。その後、生存期間を測定し、m-reMAIT細胞ならびにNK細胞の影響を考察した。結果、m-reMAIT細胞を養子移入しない群におけるAGM1抗体投与有無による生存期間の統計的な有意差は観察されなかった。一方、m-reMAIT細胞を養子移入した群ではAGM1抗体投与によって、非投与群に比して有意な生存期間の短縮が見られた。この結果はm-reMAIT細胞による胆がんマウスの生存期間延長にはNK細胞が必要であることを意味する。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はm-reMAIT細胞と NK細胞との相互作用を明らかにしてm-reMAIT細胞とNK細胞による抗がん機序を明確にして、中皮腫治療のモデルに応用する。具体的にはin vitroでiPS細胞から分化誘導したm-reMAIT細胞とB57BL/6マウス脾臓から調整したNK細胞を用いて、各細胞を単独、共培養して各細胞に如何なる変化が起こるのかを明らかにする。
解析項目
①共培養によるこれら細胞の活性化の有無：細胞の活性化はNK細胞/m-reMAIT細胞の比を変えて、各細胞において活性化マーカーであるCD25, CD44, CD69等の発現亢進の有無とその程度により測定する。②共培養によって産生されるサイトカイン・ケモカインの定量：等量のNK細胞とm-reMAIT細胞を一晩共培養して産生されるサイトカイン・ケモカインをマルチプレックスアッセイ（LegendPlex等）によって定量する。③共培養による細胞傷害活性にかかる分子の発現変動：細胞の傷害活性発揮にはエキソサイトーシスのマーカーであるCD107aの発現が強く連動している。NK細胞は一部のがん細胞に対する細胞傷害活性を発揮するので、m-reMAIT細胞との共培養あるいは単独でもCD107aの発現を亢進させる可能がある。そこで、この可能性をフローサイトメーターにて追求する。④m-reMAIT細胞の細胞傷害活性有無：これまでMAIT細胞ががん細胞に対して細胞傷害活性を発揮するのか否かは不明であった。そこで、m-reMAIT細胞単独、あるいはNK細胞との共培養により、肺がん細胞(LLC,)やNK細胞の標的がん細胞であるYac1-を殺傷するのかを明らかにする。細胞傷害活性は細胞の生死を識別する試薬であるzombieを用いて測定する。
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| Causes of Carryover |
共同研究者杉本智恵が研究代表者を務める基盤研究Bの経費(iPS細胞からのMAIT細胞分化誘導は共通研究項目）と若尾宏が大学から得た資金で２０２０年度の研究費が賄えたため。次年度は基盤研究Bの経費がないため、本経費から研究資金（研究試薬購入代、ガラス・プラスチック製品等消耗品、論文校正・印刷代等）を支出する予定である。
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