2020 Fiscal Year Research-status Report

Establishment of a Novel Evaluation System for the Effect of Transdermal Exposure to Metal Oxide Nanoparticles by a Vitrigel-mediated Co-culture System

Research Project

Project/Area Number	20K10453
Research Institution	Jikei University School of Medicine
Principal Investigator	与五沢真吾東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (70381936)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	金属酸化物 / ナノ粒子
Outline of Annual Research Achievements	金属酸化物ナノ粒子として酸化亜鉛ナノ粒子（ZnONPs）に着目し、ヒト角化細胞由来HaCaTに及ぼす曝露影響を調べた。ZnONPs 曝露時に放出される細胞外小胞成分をLC-MS/MSで分析するとCK1等の分化型ケラチンがヒットし、分化誘導の可能性が示唆されたため、その可能性を間接蛍光抗体法による細胞染色や全細胞抽出液のイムノブロットにより検討した。分化マーカーのインボルクリン(INV)の発現増加がみとめられ、Aktのリン酸化増強を伴うことがわかった。PI3K-Akt経路阻害剤でリン酸化を阻害するとINVの発現も抑制されたことから、分化誘導はAkt依存的であると考えられた。またSA-βgalの活性上昇も見られたことから細胞老化も誘導される可能性が考えられたが、Sirt1の活性低下はみられなかった。また、ヒト単球由来THP-1細胞の分化誘導の条件や表面抗原について調べた。THP-1は皮膚感作性物質を曝露した際の応答が樹状細胞と同様で、皮膚感作性試験代替法（human Cell Line Activation Test (h-CLAT)に使用されている。h-CLATでマクロファージの活性化指標に用いられているCD54・CD86発現について、ZnONPsの直接ばく露による影響を調べたところ、発現増強は確認できなかった。またZnONPsを曝露させたHaCaT由来のEV画分をTHP-1に添加しても、CD54・CD86発現の増強は確認できなかった。一方で、HaCaT細胞とヒト単球由来THP-1細胞にZnONPsを曝露させると、あるケモカインが誘導されることを見出した。さらに、この2種類の細胞を共培養することにより、そのケモカインの発現量が増強されることをELISAで確認できた。また、共培養によりTHP-1細胞にアポトーシスが誘導されることも見出した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason THP-1細胞の分化やHaCaTと共培養等の条件の検討に時間がかかってしまった。そこから酸化亜鉛ナノ粒子を曝露されたHaCaTがTHP-1に及ぼす影響を解析するのに時間を要してしまった。
Strategy for Future Research Activity	ケモカインの発現増強が共培養時に起こることを確認できたので、今後はこれがビトロゲルで仕切ってもおこるのかどうか明らかにしていく。
Causes of Carryover	共培養の実験条件が定まらなかったので、その後に予定していた実験ができず、次年度にその実験を行う予定である。