2021 Fiscal Year Research-status Report

髄膜炎菌における新規分子疫学的解析法の開発

Research Project

Project/Area Number	20K10462
Research Institution	Kanagawa Prefectural Institute of Public Health
Principal Investigator	陳内理生神奈川県衛生研究所, 微生物部, 主任研究員 (70622752)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	Neisseria menigitidis / VNTR / 分子疫学的解析法
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的は小型次世代シークエンサーであるMinION (Oxford Nanopore社)を用いて、データ共有が容易で、従来使用されているMulti locus sequencing typing(MLST)法よりも分解能の高い新規分子疫学的解析法を開発することである。この方法はMultilocus variable-number tandem-repeat analysis(MLVA) をベースとして、既報のものよりも対象領域を増やし、薬剤耐性感染遺伝子も同時検出することを目標としている。当初はまず、保有菌株のゲノム配列を決定し、それらを元にMLVAの新規領域を選択することを予定していた。また、このゲノム解析にあたり、菌株のスクリーニングとしてMLSTを予定していた。しかし、従来のサンガー法では労力がかかるものと考えられた。そこで、PCRによりMLSTの対象領域を増幅し、MinIONによりロングリードを取得することにより、対象領域を一度に配列を決定し型別することを考えた。加えて、この際に既報の領域を対象としたMLVAを同時に行うことで、スクリーニングの精度を上げることを考えた。この方法は、本研究の当初の予定であるゲノム配列を決定し、標的領域を取得し型別する方法が上手くいかなかった場合の代替法としても応用が効く。そこで、当初の予定を変更し、1年目は既報の髄膜炎菌のゲノム配列を用いて、既報の各variable numbers of tandem repeats(VNTR)領域を取り出し、そのリピート数を決定するシェルスクリプトを作成した。今年度はMLSTおよびMLVA対象領域のPCR産物について、MinIONを用いてシークエンスを決定することを試みた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 当初の予定から方針を変更し、今年度はPCRにて増幅したMLSTおよびMLVAの対象領域について、菌株ごとにバーコードをつけMinIONにてリードデータを得たのち、マッピングソフトを用いて、それぞれの領域の配列を決定することを試みた。これらによりMLSTの対象領域についてはリード配列のマッピングができたことから、対象領域の配列を決定できた。しかし、MLVA領域について、複数領域が混在した状況において、MinIONにより得られたリード配列を適切にリファレンス配列にマッピングすることができず、配列を決定するまでには至っていない。現在、マッピングのプログラムおよびパラメータ、レファレンス配列を検討している。なお、MLSTについては上記の通り、マッピングできたことから、すでに使用しているシェルスクリプトを組み合わせることで、PCR産物からのMinIONを用いたリード配列の取得と、マッピング、Sequence Typeの決定までを一連で実施することが可能となった。
Strategy for Future Research Activity	引き続き、MLSTおよびMLVAの複数の対象領域を含むPCR産物から得たロングリード配列を用いて、MLVAの対象領域の配列を決定する方法を検討するとともに、今年度は保有する髄膜炎菌株のゲノム配列を決定し、一年目に作成したシェルスクリプトを用いて、MLVA領域の配列を決定し、型別することを試みる。
Causes of Carryover	当初1年目に予定していたゲノム解析を3年目に行うことに変更したことにより生じた。残額はゲノム解析およびゲノム解析用の菌株のスクリーニングに使用する。