髄膜炎菌における新規分子疫学的解析法の開発

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K10462
• Research Institution: Kanagawa Prefectural Institute of Public Health
• Principal Investigator: 陳内 理生 神奈川県衛生研究所, 微生物部, 主任研究員 (70622752)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 髄膜炎菌 / MLVA / 分子疫学的解析法

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は小型次世代シークエンサーであるMinION (Oxford Nanopore社)を用いて、データ共有が容易で、従来使用されているMulti locus sequencing typing(MLST)法よりも分解能の高い新規分子疫学的解析法を開発することである。保有菌株のゲノム配列を決定し、 それらを元にMLVAの新規領域を選択する方法と、予備的な手法としてPCRによりMLVA領域を増幅したものについて、MniIONにより配列決定を行う方法の2つの方向で検討していた。予備的な方法としていたPCRの増幅産物からMLVA領域を決定することを先に試み、1年目は既報の髄膜炎菌のゲノム配列を用いて、既報の各variable numbers of tandem repeats(VNTR)領域を取り出し、そのリピー ト数を決定するシェルスクリプトを作成した。2年目にMLVA対象領域のPCR産物について、MinIONを用いてシークエンスを決定することを試みたが、MLVA対象領域は類似性が高く、正確なアセンブルが困難であった。3年目となる今年度に、アセンブル方法の再検討を実施したが正確なアセンブルを得ることができなかった。また、今年度はこれと並行して、髄膜炎菌株ライブラリにおけるコンプリートゲノム配列の取得を目標として、まずショートリード取得用のゲノム抽出法の検討を行った。市販キットとフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（PCI）抽出法の比較を行い、市販キットでも一定の精製度を得ることができたが、よりPCI抽出法でより高い精製度のDNAを得ることができた。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

新型コロナウイルス感染症の影響により1年目、2年目に必要物品が不足するとともに、菌株の輸送予定が遅れた。このような状況はほぼ改善したことから、研究を進展させているものの、当初の終了予定であった、今年度には終了できず、1年計画を延長した。

Strategy for Future Research Activity

今年度は髄膜炎菌ライブラリについて、ショートリードを得たのち、MLSTを解析する。その結果を元に、コンプリートゲノム配列を決定する株を選択し、ロングリードを得る。得られたロングリードおよびショートリードをハイブリッドアセンブルし、コンプリート配列を得たのち、それらをもとにMLVA対象領域を再検討し、新規MLVA法の開発を行う。

Causes of Carryover

研究の実施状況の遅れにより生じた。次年度は物品購入のほか、NGS解析の委託を実施する予定である。