2021 Fiscal Year Research-status Report
A multilateral approach to the diagnosis of sudden cardiac death centering on DNA methylation
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20K10569
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| Research Institution | Kansai Medical University |
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Principal Investigator |
橋谷田 真樹 関西医科大学, 医学部, 准教授 (40374938)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | DNAメチル化解析 / 心臓突然死 / 次世代シークエンサー / ゲノム変異解析 / miRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
解剖時に採取した心筋から抽出したゲノムDNAを試料とし，次世代シークエンサーを用いて心疾患関連遺伝子および薬剤代謝関連遺伝子の変異解析を行った．死因が心臓突然死と思われる15例から試料を採取した．年齢は０歳から90歳であり，男性11例，女性４例，2歳以下の乳幼児９例を含んでいる．心疾患関連遺伝子はThermo Fisher Scientific社のIon AmpliSeq Designerツールを用いて282遺伝子，計5404 SNPを一度に増幅するプライマーセットを設計・作成した．また，薬剤代謝関連遺伝子の解析にはIon Ampliseq Pharmacogenomics Panelによる119遺伝子，137 SNPを解析するプライマーセットを用いた．増幅後，Ion Chef Systemで前処理を行い，Ion GeneStudio S5を用いてシークエンス，Plug-inソフトウェアおよびクラウドのIon Reporterを用いて多型解析を行なった．心疾患関連遺伝子解析では，標準ヒトゲノム配列hg19と比較したところ，それぞれの試料においてSNPが570から933個（平均769.5個）検出された．次にそれらのSNPをClinVar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)データベースを用いてフィルタリングしたところ，平均8.7個の病原病原性疑いがあるSNPが検出された．これにより心疾患関連遺伝子の解析は突然死の死因究明に有効であったと考えられる．次に薬剤代謝関連遺伝子の解析では137SNPタイピング結果が得られているが，中でも特にCYP1A, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4遺伝子は薬物代謝に重要な役割を担っており，この部分のSNPに関しては，それぞれの処方された薬物と照らし合わせて判断する必要がある．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度はホルマリン固定され，パラフィン包埋された臓器片を試料として，次世代シークエンサーを用いての心臓疾患関連遺伝子の変異解析を行なった．今年度は，心臓突然死の剖検例で採取した心筋中隔試料からDNAを抽出し試料とした．次世代シークエンサー（Ion S5 GeneStudio System）を用いての解析には変わらないが，ターゲットとなる心臓疾患遺伝子群，282遺伝子，計5404 SNPを一度に増幅するプライマーセットを，Thermo Fisher Scientific社のIon AmpliSeq Designerツールを用いて新たに設計・作製した．９例の乳幼児を含む１５例の心臓突然死例の解析を行なったところ，病原性の疑いがあるSNPがそれぞれの試料で確認され，突然死例における遺伝子解析の有効性が再確認された．さらに，薬剤代謝関連遺伝子119遺伝子，計137 SNPの変異解析は，市販のon Ampliseq Pharmacogenomics Panelを用いて行なった．しかしながら，こちらはそれぞれの処方された薬物と照らし合わせて判断する必要があり，更なる精査と考察が必要である．このように，これまでに血液はもちろん，心筋試料やパラフィン包埋試料からの遺伝子変異解析に関するプロトコルが確立されており，肉眼解剖による所見だけでなく，遺伝子検査の結果も含めた死因判断の必要性が再確認されている．以上がこれまでの進捗状況である．
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は研究の最終年度にあたることから，残りの解析，つまり，心筋のメチル化解析とmiRNAの解析を行う予定である．まず，心筋から抽出済みのDNAを用いて，ホールエクソンに近いメチル化解析を行う．これには高性能の次世代シークエンサー(MethylationEPIC BeadChip Kit, iScan System, GenomeStudio Software)が必要となるため，対照試料を含めた８サンプルを外注で解析することにする．その結果得られた情報から突然死例に特徴のあるメチル化部位をいくつか特定し，心臓突然死メチル化マーカー候補とする．次に当大学にある次世代シークエンサー(Ion S5 GeneStudio System)を用いて他の試料を解析し，試料数を増やして心臓突然死例特有のメチル化マーカーを確立する．miRNAの解析については，既報の情報からカテコラミン関連のmiRNAの中から12種， miRNA-1, miRNA-21, miRNA-23a, miRNA-125a, miRNA-133b, miRNA-135b, miRNA-208, miRNA-210, miRNA-514, miRNA-548, miRNA-562, miRNA-624を選択し，解析することとする．心筋からsmall RNAをキットで抽出後，専用のプライマーで増幅，プロトコルに従ってライブラリーを調整し，on S5 GeneStudio Systemにより解析を行う． 令和3年度に獲得したゲノム変異情報を加えて，計３つの情報から心臓突然死に対して多角的なアプローチを行うことで，これまで困難であった心臓突然死例の診断方法を確立する．
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| Causes of Carryover |
今年度も次世代シークエンサーを用いたゲノム変異解析を行い，そのための試薬類を購入使用した．しかしながら，以前購入した同様試薬類が残存しており，そちらの方から優先的に使用したため，購入試薬予算に余裕ができ，来年度への持ち越しが若干発生した．
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