2021 Fiscal Year Research-status Report

三次元培養筋におけるコレシストキニン遺伝子発現制御および分泌動態の解明

Research Project

Project/Area Number	20K11434
Research Institution	Osaka Institute of Technology
Principal Investigator	中村友浩大阪工業大学, 工学部, 教授 (30217872)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	北村憲司広島大学, 自然科学研究支援開発センター, 准教授 (40214811) 藤里俊哉大阪工業大学, 工学部, 教授 (60270732)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	三次元培養筋 / マイオカイン / コレシストキニン
Outline of Annual Research Achievements	2021年度は、マウス筋細胞株C2C12におけるCckタンパク質の発現動態およびHif1a siRNAを利用した遺伝子のノックダウンによるCck遺伝子の発現への影響を検証した。その結果、免疫染色およびウエスタン解析から平面培養条件においても分化期においてCckタンパク質の構成的な発現が確認された。また、電気刺激負荷に伴う筋収縮の効果を検証したところ、細胞内の構成的な発現上昇は観察できなかった。また、培地中への分泌動態を検討したところ、電気刺激の有無に関係なく検出されなかった。また、低酸素特異的な転写因子であるHif1aとの直接的な関与を検討するために、Hif1a siRNAを利用した遺伝子のノックダウンによるCck遺伝子の発現への影響を検証した。その結果、Hif1a発現のノックダウンでCck遺伝子発現が低下することが明らかとなった。以上の事から、平面培養筋および３次元培養筋において細胞内Cckタンパク質の構成的な発現が確認できること、細胞外への分泌は非常に少ないか、分泌されない可能性があること、低酸素特異的な転写因子であるHif1aを介した直接的な制御が行われている可能性が示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 筋芽細胞株C2C12細胞におけるCckタンパク質の発現動態を検証したところ、分化期の平面培養および３次元培養筋において構成的な発現が観察された。また、３次元培養筋から培地への分泌は検出できなかった。Hif1a siRNAによる遺伝子ノックダウンを試行したところ、少なくてもミオゲニンマーカーによる低下は観察されず、分化抑制がみられなかったため、Cck遺伝子の発現を評価した。その結果、Hif1aノックダウンによってCck遺伝子の発現が低下する現象を確認できた。筋細胞株C2C12に発現するCck遺伝子の発現制御にはHif1a転写因子の直接的な関与があることを示唆することができた。
Strategy for Future Research Activity	2021年度は、Cckタンパク質の細胞内構成的な発現とHif1aタンパク質との直接的な関与を解析することができた。2022年度は、Hif1a遺伝子ノックダウンによるCckタンパク質発現への影響、Cck発現抑制に関与するTrim33との関連性を探るとともに、長期的な電気刺激条件での培地への分泌動態を検証したい。
Causes of Carryover	学会発表等の対面学会参加を予定していたが、コロナ感染拡大のため、オンライン参加となり、旅費を使用できなかったため。使用計画としては、研究成果発表としての国内学会出張費として使用予定である。