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2020 Fiscal Year Research-status Report

卵巣がんにおけるNAC1-PEPCKによる栄養素代謝制御機構の解明

Research Project

Project/Area Number 20K11585
Research InstitutionThe University of Shimane

Principal Investigator

中山 真美  島根県立大学, 看護栄養学部, 教授 (60713188)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 中山 健太郎  島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 准教授 (70346401)
Project Period (FY) 2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords癌代謝 / 糖新生経路 / NAC1 / PEPCK2 / メタボローム解析
Outline of Annual Research Achievements

我々はこれまでに、新規がん関連転写因子NAC1を卵巣がんにて同定し、癌治療における新規標的分子となりうることを報告してきた。その後の研究でNAC1の下流遺伝子候補として、PEPCKをコードするPEPCK2を同定している。本研究では卵巣がんにおけるPEPCK発現の意義および、NAC1によるPEPCKの発現制御、そしてNAC1-PEPCKを介したがん代謝制御機構を明らかにすることを目的としている。NAC1,PEPCK2共発現細胞株OV207においてsiRNAにてNAC1をknockdownするとPEPCK2の発現が抑制されることを確認した。次にNAC1(-)細胞株であるRK3E細胞を用いて、NAC1強発現によりPEPCK2の発現亢進を確認した。これにより、転写制御因子NAC1によるPEPCK2の発現制御の可能性を確認した。
さらに卵巣がんの発育進展におけるNAC1-PEPCK2の関与を確認するため、OV207を用いてGrowth assayを行った。NAC1,PEPCK2それぞれをsiRNAにて発現を抑制することで細胞増殖が抑制されることを確認した。NAC1のPEPCK2の制御機構に関して、直接的か否かを確認するため、PEPCK2のpromotor領域をオリゴで合成しpromotor assayを実施した。RK3E細胞において、NAC1強制発現によるPEPCK2のpromotor活性上昇、OV207細胞において、NAC1発現抑制による同活性低下を確認した。さらに我々が同定したNAC1結合DNA配列をPEPCK2 promotor領域に6個目視で同定した。どの結合配列がNAC1による転写制御に重要であるかを同定するために、それぞれの塩基をアラニンで置換したalanine mutantを作成した。今後はChIP assayにより、各結合配列とNAC1の直接結合を確認する予定である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

卵巣がん細胞株を用いた実験で、NAC1によるPEPCK2の発現制御が確認できた。
現在より詳細な発現制御機構の解明に向けて研究を進めている。
現在のところ、卵巣がんにおいて、PEPCK2による代謝制御機構の解明に関する報告は出されておらず、本研究を進めることで卵巣がん代謝に関する新たな知見が得られる。

Strategy for Future Research Activity

NAC1によるPEPCK2の発現制御が直接結合によるものかどうかを確認するため、今後はChIP assayにより確認する予定である。また、どのDNA結合配列が重要かを同定するために、本年度作成したPEPCK2 promotor領域のmutasntを用いてChIP assayおよびpromotor assayを実施する予定である。
本年度NAC1-PEPCK2経路ががん細胞の代謝制御にどのように関与しているかを確認するため、メタボローム解析を実施した。OV207細胞を用いて、siRNAによりNAC1をknockdownし、コントロールと比較して代謝産物の量的変化を、結果から比較検討する予定である。それにより、NAC1-PEPCK2によって制御されている代謝パスウェイが同定される予定である。同様の解析を、他のNAC1, PEPCK2発現細胞株を用いても確認する予定である。
今後、癌組織切片を用いた免疫染色法にて、NAC1とPEPCK2の発現量の相関を確認し、さらに予後との関連を検討する予定である。

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Published: 2021-12-27  

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