2021 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of a connection between feeding-regulating peptide and the immune system
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20K11610
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| Research Institution | Kiryu University |
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Principal Investigator |
影山 晴秋 桐生大学, 医療保健学部, 教授 (00433839)
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2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 神経ペプチド / 免疫染色 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ガラニン様ペプチド（GALP）は摂食調節に関わる神経ペプチドである。これまでの報告より、ラットにおいてGALPは視床下部弓状核に限局していることが明らかとなっている。しかしながらGALPは循環血液中でも存在していることから、脳以外の器官においてもGALPを産生している可能性がある。これまでに脂肪細胞においてGALP遺伝子が発現していることを見出している。引き続き当該研究でも、末梢組織におけるGALPの分布の解明をおこなっている。前年度は胸腺にGALP mRNAの発現とGALP免疫陽性が認められたことから、今年度はGALP免疫陽性の細胞同定をおこなった。
胸腺には、Tリンパ球、Bリンパ球、単球・マクロファージ、間質細胞や樹状細胞が存在している。今回は、単球・マクロファージ・NK細胞のマーカーである抗インテグリンαX（CD11c）抗体が抗原を認識しているかを確認するために、ラット胸腺を単染色した。パラフィン切片および凍結切片を用いて、ストレプトアビジン―ビオチン複合体(ABC増幅法)によるDAB染色を行った。その結果、免疫染色陽性反応を認められなかった。
抗GALP抗体のホスト（ウサギ）と二重免疫染色を行うために、ホストの異なる種の抗体を使う必要がある。多くの抗体はウサギをホストとするために二重免疫染色が可能な市販されている抗体は少ない。今回の抗体を用いて、免疫染色の条件を再検討することと、細胞同定を二重免疫染色ではなくミラー切片に切り替え、ホストが同じ抗体でも免疫染色可能な抗体を購入し、細胞同定を試みる。また樹状細胞のマーカーである抗CD-40抗体あるいは抗Thymic Stromal Lymphoprotein（胸腺間質性リンパ球新生因子）抗体を使って、細胞同定を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
胸腺にGALP産生細胞があることは免疫染色法にて同定することができたので、このGALP陽性細胞がどのような性質の細胞なのかを同定すべき今年度は計画した。
コロナ禍の影響で、なかなか抗体が入荷しなかったことと、抗体の製造を取りやめてしまった抗体があり、実験が進まなかった。また免疫二重免疫染色を行う上で、ホストを考慮した抗体選択が思うようにできなかったことで、全体の実験が遅れてしまった。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度にできなかったGALP産生細胞の同定を行う。さらに前年度計画を立てた実験を行う予定である。
１．可能な限り、凍結切片またはパラフィン切片で抗GALP抗体との蛍光二重免疫染色が可能である抗CD40抗体、抗CD11c抗体や抗胸腺間質性リンパ球新生因子抗体を選び、GALP産生細胞の同定を行う。または抗GALP抗体と同じウサギをホストとした抗CD40抗体や抗CD11c抗体を購入し、ミラーセクションによって、細胞同定を行う。
2．GALP脳室内投与による胸腺への作用および二次リンパ組織に及ぼす効果
リポポリサッカライド（LPS）または生理食塩水を腹腔内に投与し、深部体温上昇によって炎症が起きていることを確認する。GALPまたは生理食塩水を脳室内投与し、６時間後に4％パラホルムアルデヒドで灌流固定を行う。二次リンパ組織である回腸パイエル板を摘出し、パラフィン切片を作成後、パイエル板のリンパ小節にある胚中心と傍濾胞域のリンパ球の変化を免疫組織学的に観察し、GALPの免疫機構への関与を検討する。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍の影響で、消耗品（プラスチック製製品）、細胞同定用の抗体の入荷が遅れた。また製造が中止となった抗体もあり、実験を進めることができなかった。また二重免疫染色による細胞同定が可能な細胞マーカー抗体の選定に時間がかかってしまい、本年度行う予定だった実験を次年度に回すことにした。このために今年度使用額に差額が生じた。次年度は、2021年度に行う予定だった実験を行い、遅れている実験の消耗品の購入費用に充てる予定である。
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