2020 Fiscal Year Research-status Report
BioIDシステムを利用したDNA修復因子SLX4の制御機構の解析
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20K12161
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
勝木 陽子 京都大学, 生命科学研究科, 特定講師 (00645377)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | SLX4 / ICL修復 / ファンコニ貧血経路 / ユビキチン化 / フォーカス形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、ファンコニ貧血(FA)原因遺伝子SLX4/FANCPのユビキチン化経路を介した集積メカニズムの解明を目的とする。SLX4はDNA修復におけるエンドヌクレアーゼ複合体因子で、N末端にUBZ4型ユビキチン結合モチーフをもつ。このUBZ4ドメインのホモ欠失変異により患者がFAを発症すること、ユビキチン結合変異体の発現細胞がクロスリンク(ICL)損傷剤に高感受性であることから、このドメインはFA発症を抑制するICL修復に必須と考えられている。既報からSLX4 UBZ4はK63ポリユビキチン鎖に結合し、損傷部位への集積に機能するが、そこに介在するユビキチン化経路の分子メカニズムは明らかにされていない。
(1)これまでに、SLX4のN末部分のアミノ酸配列（N末約半分に相当）をGFP融合タンパク質（GFP-SLX4-N）として細胞に発現させ、UBZ4依存的な損傷部位への局在を単純化・明瞭化できるシステムを樹立、siRNAライブラリーによるスクリーニングの結果、E3リガーゼRNF168を同定した。本年度はUBZ4の会合因子を探索するため、共同研究によって質量分析を実施した。当初の計画では、近位依存性ビオチン標識法(BioID)を用いる予定であったが、まずは既存のGFP-SLX4-N発現細胞で低濃度クロスリンク剤によるタンパク質間架橋を行い、GFP-Trapによる免疫沈降物を解析した。SLX4 UBZ4ドメイン野生型およびユビキチン結合変異型を発現する細胞株を比較し、会合因子の同定を試みた。
(2)レンチウイルスベクターによってBioID法に用いるTurboID-GFP-SLX4-N発現細胞株を作製し、ウェスタンブロッティングによる発現の確認、および蛍光イメージングによる局在を観察した。損傷誘導後、ビオチン存在下でSLX4-Nと共局在するビオチンシグナルの上昇の確認を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
質量分析によってSLX4 UBZ4ドメインの会合因子の同定を試み、いくつかの候補因子を得たが、SLX4自体の検出数が少なかったため、サンプルのクオリティをあげる必要がある。用いた細胞株のGFP-SLX4-Nの発現量が低かったこと、またSLX4-Nがやや難溶性タンパク質である可能性が示唆された。現在、高発現細胞株の再樹立と可溶化条件の検討をおこなっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の予定を変更して、クロスリンク剤によるタンパク質架橋条件下でGFP-SLX4-Nを抽出後、免疫沈降―質量分析による会合因子の探索を優先して進める予定である。現在行っているGFP-SLX4-N高発現細胞株の再樹立を完了し、可溶化条件を決定次第、質量分析を再度試みる。タンパク質間架橋による同定が困難であると判断した場合、すみやかにBioIDを実施するため、UBZ4変異体TurboID-SLX4-N発現細胞株の構築を同時に進める。
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| Causes of Carryover |
2020年度の研究計画実施にあたり、他大学研究所との共同利用に採択され、当初予定していた質量分析などにかかる費用の負担が軽減された。また国内の学会参加は新型コロナウイルス感染症の感染拡大により中止となり、当該年度の旅費にかかる経費を使用しなかった。
次年度SLX4 UBZ4結合因子を同定し、その機能を検討するための分子生物学的解析に用いる試薬、消耗品の必要経費が当初の予定を上回ることが見込まれる。高額な試薬やキット製品、解析費用に充てる計画である。
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