2020 Fiscal Year Research-status Report

酸化的 DNA 損傷に対する人為的な修復亢進ー色素性乾皮症治療を目指してー

Research Project

Project/Area Number	20K12167
Research Institution	Nara Medical University
Principal Investigator	杉浦重樹奈良県立医科大学, 医学部, 教育教授 (40179130)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	森俊雄奈良県立医科大学, 医学部, 研究員 (10115280)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	DNA 修復 / サイクロプリン / 修復亢進
Outline of Annual Research Achievements	我々は紫外線損傷の１つであるシクロブタン型二量体 (CPD) について抗 CPD モノクローナル抗体の Fab に核移行シグナルと制限酵素 FokI のヌクレアーゼドメインを融合させた核移行型 Fab-FokI が CPD の修復亢進することをすでに確かめている。CPD はサイクロプリン同様ヌクレオチド除去修復により修復されることから、核移行シグナル及びダイマー形成出来ない変異体 FokI(KK) のヌクレアーゼドメインを抗 Cyclo-dA モノクローナル抗体の Fab に融合させ、Cyclo-dA 特異的エンドヌクレアーゼ［VH-CH1-NLS & VL-CL-NLS-FokI(KK)］を作製し、その発現系を構築した。次ぎに酸化的 DNA損傷を誘発するため、コンタクトインヒビションを起こした不死化正常ヒト線維芽細胞をミトコンドリア阻害薬である Rotenone, Antimycin A, BSO 及び過酸化水素で９日間処理を行った。これらの細胞から DNA を抽出し Cyclo-dA を ELISA で定量したところ、未処理のものと比較し有意な差は認められなかった。我々が作製した抗 Cyclo-dA モノクローナル抗体は、Cyclo-dA に対して特異性が高く、10^6 塩基に１個のCyclo-dA を検出出来る一方で、 DNA に対する非特異的結合が若干見られる。このDNA に対する非特異的結合を抑えるにはどのアミノ酸を変化させれば良いか考察するため、他の抗 DNA 損傷抗体やDNA 結合抗体とアミノ酸配列について比較を行い、軽鎖 CDR3 内のアミノ酸を変化させた変異体２種を作製した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason Cyclo-dA 特異的エンドヌクレアーゼ［VH-CH1-NLS & VL-CL-NLS-FokI(KK)］を作製し、その発現系を構築した。このCyclo-dA 特異的エンドヌクレアーゼが効率良く機能するには、Cyclo-dA 認識部位の特異性が高く検出感度が高い方が有利であるため、軽鎖 CDR3 内のアミノ酸を変化させた変異体２種を作製した
Strategy for Future Research Activity	軽軽鎖 CDR3 内のアミノ酸を変化させた変異体２種と元の抗 Cyclo-dA モノクローナル抗体の三者について、Cyclo-dA に対する結合性を比較し、一番優れているものについて Cyclo-dA特異的エンドヌクレアーゼ［VH-CH1-NLS & VL-CL-NLS-FokI(KK)］を作製し、修復亢進の評価に用いる。ミトコンドリア阻害薬の処理では細胞に酸化的損傷を十分量誘発することが出来なかったことから、効率的な誘発条件を早急に確立し、 Cyclo-dA 特異的エンドヌクレアーゼによる修復亢進を評価する。