細胞内架橋分子Plectinの放射線誘発DNA損傷応答における新規機能の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K12170
• Research Institution: Kanazawa Medical University
• Principal Investigator: 松井 理 金沢医科大学, 医学部, 助教 (60288272)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: Plectin / 53BP1 / p53

Outline of Annual Research Achievements

我々はこれまでにPlectinと53BP1が細胞内で結合していることを見出したが、この結合は放射線照射の有無に関わらず認められる。一方、53BP1は放射線照射によりDNA二本鎖切断（DSB）部位に集積することが知られているが、PlectinのDSB部位への集積はこれまでに確認できていない。以上から我々は、Plectinが結合している53BP1はDSB部位へ集積せず、これまでに知られているものとは全く機能や種類の異なる53BP1複合体なのではないかと予想した。そこで、このことを解明する糸口を得るために、まず53BP1の Plectinとの結合領域を調べることにした。53BP1の機能に関わる領域として、p53との結合に必要な領域、DSB部位集積に必要な領域、DSB修復の制御に必要な領域などが既に知られており、これらの領域を様々な組合せで欠失させた53BP1発現ベクターを作製した。これらをヒト培養細胞に導入しPlectinとの結合領域を調べようとしたところ、産生された組換え蛋白質のうちいくつかは元々細胞にある内在性53BP1と結合し複合体を形成してしまうことが明らかになった。そこでこの問題を解決するために、内在性53BP1を欠失させた細胞の作製を試みた。２種類のcrRNA（cr53BP1-1、cr53BP1-2）を用いてCRISPR/Cas9により53BP1欠失細胞の作製を試みたところ、cr53BP1-1の方は調べた48クローン中1クローン、cr53BP1-2の方は調べた39クローン中2クローンの細胞が内在性53BP1を完全に欠失していた。得られた53BP1欠失細胞に前述の様々な発現ベクターを導入し、組換え蛋白質に付加されたHAタグについて免疫沈降を行い、Plectinが共沈するかどうかを調べた結果、p53との結合に必要な領域やDSB部位集積に必要な領域を含まない53BP1のN末端側半分の領域とPlectin が結合することが明らかになった。このことは、Plectinの結合が53BP1のDSB部位への集積やp53との結合とは完全に独立していることを示唆している。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

Plectinと53BP1との結合領域を決定するために新たに内在性53BP1を欠失させた53BP1ノックアウト細胞の作製が必要となり、この作製に手間取ったため研究計画に遅延が生じている。

Strategy for Future Research Activity

我々がPlectin結合領域として同定した53BP1のN末端側半分の領域については、これまでに、放射線照射後にATMキナーゼでリン酸化される多数のセリン・トレオニン残基を含み、このリン酸化アミノ酸残基を標的としてその後のDNA損傷応答に関与する蛋白質が結合すると考えられている。一方、放射線照射後に53BP1はATMキナーゼ依存的にDSB部位へ集積することが知られているが、Plectinは我々のこれまでの観察ではDSB部位への集積は認められておらず、おそらくDSB部位に集積した53BP1にPlectinは結合していないと考えられる。このことから、ATMキナーゼによるリン酸化が放射線照射後のPlectinと53BP1の結合を制御していることが予想され、今後はこの点を明らかにするために研究を進める。