2020 Fiscal Year Research-status Report
Identification of novel carcinogenic mechanisms for mammary gland induced by lipid-mediators
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20K12186
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| Research Institution | Meijo University |
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Principal Investigator |
岡本 誉士典 名城大学, 薬学部, 准教授 (50512323)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 乳がん / エストロゲン / 脂質メディエーター / ゲノム編集 / メタボロミクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
エストロゲンは内因性ホルモンであり，生殖システムをはじめ広範囲な生体機能の調節に関与している．一方，エストロゲンの負の側面として，乳がんをはじめとする婦人系がんのリスクを上昇させることが知られている．申請者はこれまでに，エストロゲン誘発性乳がんモデルラットの血清Lipidomics解析によって，脂質シグナル分子であるLysophosphatidic acid（LPA）の前駆体Lysophosphatidylcholine（LPC）が発がんラットにおいて上昇することを見出している．したがって本課題は，LPAの生成・機能に関与するタンパク質をゲノム編集技術で破壊した遺伝子改変ラットを作製し，LPAがエストロゲン誘発性乳がんの形成に重要な役割を担っているかどうか明らかにすることを目的とする．遺伝子改変ラットを作製するための予備的な検討として，令和2年度にはラットの遺伝子改変に適切と思われるcrRNA配列のスクリーニングを実施した．ラット由来C6細胞株のゲノムDNAを用いたCas9タンパクによるin vitro cleavage assayにおいて，効率的な切断活性がみられる複数のcrRNA配列を決定した．続いて，それらのcrRNAによる細胞レベルでの変異導入効率を評価するために，crRNA-tracrRNA-Cas9タンパク複合体をC6細胞にトランスフェクションして数日間培養後，得られたゲノムDNAを用いてT7エンドヌクレアーゼI試験を実施した．その結果，細胞レベルでも変異導入されることが確認でき，さらにその効率はin vitro cleavage assayの結果と高い相関性がみられた．次年度には，遺伝子改変動物の作製に向けて動物レベルの実験を展開する予定である．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和2年度は，新型コロナウイルス感染症の影響で十分な実験時間を確保することができない中，当初の目的である「ゲノム編集に適切なcrRNAを選定する」ということを達成できた．詳しくは，LPA受容体-1遺伝子のノックアウト作製用crRNAを複数選定することができている．しかしながら，エストロゲン受容体αについては，選定途中であることから，「おおむね順調に進展している」が適当であると判断した．
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度は，実際にラット個体を用いたゲノム編集を進める予定である．まずは，EGFP mRNAを用いエレクトロポレーションを行い，EGFP陽性のラット受精卵をカウントすることによって，受精卵への導入条件の最適化を進める．その後，実際にcrRNA-tracrRNA-Cas9タンパク複合体を導入し，本年度内にはラットLPA受容体-1遺伝子欠損ラットの作製を目指す．これらと並行して，ラットエストロゲン受容体αを欠損させるためのcrRNAを選定していく予定である．
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| Causes of Carryover |
令和2年度中にも動物実験を開始できるように予算を一部残しておいた．しかしながら，遺伝子組み換え実験等の倫理審査を進めるにあたり実験開始が年度内に間に合わず，結果的に次年度に実施することとなったため，残予算が生じた．
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