2020 Fiscal Year Research-status Report

Environmental DNA biobanking: trans-kingdom parallel analysis of eDNA from fauna/flora to microbiota including pathogens

Research Project

Project/Area Number	20K12258
Research Institution	University of the Ryukyus
Principal Investigator	佐藤行人琉球大学, 戦略的研究プロジェクトセンター, 特命講師 (20566418)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	環境DNA / バイオバンキング / メタバーコーディング / 次世代シークエンサー / 病原体 / 生物相 / 動物相
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、微生物（バクテリア、病原体など含む）から各種の動植物（魚類、甲殻類、節足動物、四足類など含む）までの広い分類群を対象とした環境DNA分析（トランスキングダムなDNA解析）の手法開発と実施により、沖縄県の都市部（南部）とやんばる（北部）から取得される環境DNA生物相情報を比較解析することで、生物・病原体の分布、種多様性、遺伝的多様性から、人間活動・都市環境パラメータとの相関などを分析し、さらに時間追跡研究を行う基盤の構築を試みることが目的である。初年度（2020年度）は、まずフィールドワークのパートとして、やんばる（北部）のサンプリングルートの確立と実施、都市部（南部）のサンプリングルートの検討を行った。北部やんばるについては、およそ全域を粗にカバーする13か所の主要水系など（大浦湾、慶佐次川、福地川、新川ダム、安波川、与那川、比地川、辺野喜川、宜名真川、辺戸岬の小河川、奥川、伊部川、源河川）を1.5日で周回しサンプルリングするルートを確立することができた。目標数の目安となる25か所へとポイント数を増加させるために、次年度もサンプリング手順を検討予定である。都市部（南部）については、県などの調査でも一部汚染等が報告される報得川、雄樋川、小波津川について、サンプリングポイントとルートの検討を行い、作業用マップを作製した。次年度より北部と南部で、時期を揃えたサンプリングを開始する予定である。また、河川や灌漑水など陸水の環境DNA分析による病原体や宿主動物の検出手法開発も進捗した。以前から共同研究を行ってきたスリランカ・ペラデニヤ大学医学部のチャンディカ・ガマゲ教授らと共に、現地の環境DNAサンプルから、沖縄でも流行がある病原細菌レプトスピラと、その宿主動物（ウシ、スイギュウ）の同時検出に成功し、そのサンプル常温輸送法も記載した査読付き英文論文を発表することができた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究で計画した内容について、まず環境DNAサンプルのサンプリングポイント数については、北部やんばるについて目標のおよそ50%を達成し、南部では目標のおよそ30%において実施準備が整った段階にある。2020年度の特殊な事情として、新型ウィルス感染症の流行状況によって県内出張を控えざるをえない時期が数か月以上に及び、当初の予定よりも達成数が下回った。しかしながら、主要な目的地をカバーするサンプリングルートの概要確立については、初年度の時点ですでに半分以上の達成度であると考えた。バクテリアから動植物まで同時検出し相関解析を行う環境DNA手法の開発では、まず、病原体の細菌レプトスピラと、それらの宿主動物となりうる脊椎動物（四足類、魚類、両生爬虫類）を同時検出し解析する手法を確立することが出来て、該当分野のトップジャーナルの１つである PLOS Neglected Tropical Diseases に、共同第一著者および責任著者として論文を発表することが出来た（Gamage, Sato, et al. 2020. PLOS Neglected Tropical Diseases, 14, e0008437）。このため、環境DNA解析手法の開発についても、比較的順調に進展していると考えた。
Strategy for Future Research Activity	今後の推進方策として、まず環境DNAサンプリングについては、次年度以降、沖縄県都市部（南部）のサンプリングの実施と、時期を揃えたやんばる（北部）でのサンプリングを行い、バクテリアから動植物（希少種・外来種を含む）の同時分析を行う環境DNA取得とバイオバンキングを進める予定である。さらに、トランスキングダムな環境DNA解析の手法開発面では、現在までに検出・解析が成功している河川バクテリア（病原細菌レプトスピラを含む）と脊椎動物とは、また別の大生物群である甲殻類、植物、病原体（Coxiella やヘリコバクターピロリ菌などを含む）、薬剤耐性菌（遺伝子、プラスミドも含む）などについて、最適なPCRプライマー探索やPCR条件検討、次世代シークエンシング解析の実施、データ解析手法の確立と実績化（オリジナル参照配列データベースの整備や、関連プログラム開発、論文化など）を進めていく予定である。