2020 Fiscal Year Research-status Report

自律神経作用を付加したon chip心筋モデルの構築

Research Project

Project/Area Number	20K12613
Research Institution	National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
Principal Investigator	高山祐三国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (60608438)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	自律神経 / 心筋 / ヒトiPS細胞
Outline of Annual Research Achievements	初年度ではまずヒトiPS細胞からの自律神経スフェアの誘導法構築を行った。これまでの研究代表者らによるヒト自律神経誘導法では培養環境による交感神経/副交感神経の選択的誘導を可能としていたが、それゆえに同一培養環境上で交感神経と副交感神経を共培養することが困難であった。この課題を克服するために、予め異なる培養環境を用いて３次元交感神経スフェア及び副交感神経スフェアを作製し、その後心筋組織上へと播種することで自律神経系と心筋組織との共培養を行うことを想定した。自律神経スフェアの作製にはヒトiPS細胞から胚様体を誘導し、自律神経誘導から神経成熟期間までを浮遊培養を行うことで行った。特に副交感神経誘導には研究代表者らがこれまでに報告した手法である、誘導培地にレチノイン酸(RA)とPKCシグナル活性剤であるPMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate)とBDNFを添加した培地を使用した。作製した交感神経/副交感神経スフェアの解析を行うためにqPCR等による遺伝子発現解析を行った結果、作製した交感神経/副交感神経スフェアにおいてそれぞれのマーカー遺伝子であるTHやDBH (交感神経マーカー）、CHAT (副交感神経マーカー）の発現上昇が確認できている。また、作製した３次元状のスフェアを培養ディッシュ上に播種し培養することで、スフェアからの神経突起伸展を確認しており、自律神経系としての構造・機能を有することを確認できている。一方で作製した自律神経スフェアには末梢神経系におけるグリア細胞であるシュワン細胞が多数含まれることも確認しており、自律神経機能への影響を解析しつつ悪影響がある場合にはより神経誘導効率を高める培養プロトコルの構築を行う予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の目標である自律神経スフェア構築に目途を立てたため、研究進捗に遅延は無いと判断した。
Strategy for Future Research Activity	今後は作製した自律神経スフェアを心筋組織との共培養系構築を行う。共培養した自律神経-心筋組織の機能解析にはカルシウメイメージングや微小電極アレイ基板システム (MEA)を用いた電気活動計測を行う予定である。
Causes of Carryover	新型コロナ流行により旅費の使用用途が無くなる、テレワーク推奨により実験作業を行う補佐員の雇用等の理由により当初の使用計画より変更があったため、結果的に予算に余剰が生じた。次年度使用額と合わせた予算の使用について、自律神経－心筋組織共培養実験を円滑に行うために心筋組織の購入や細胞培養試薬等に重点的に使用する予定である。