2021 Fiscal Year Research-status Report
ヒト多能性幹細胞に由来する心臓オルガノイド作製のための基盤技術開発
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20K12623
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
白吉 安昭 鳥取大学, 医学部, 准教授 (90249946)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
經遠 智一 鳥取大学, 医学部, 助教 (60730207)
森川 久未 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究員 (90707217)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | オルガノイド / ヒトiPS細胞 / 心筋 / イオンチャネル / ペースメーカ細胞 / 蛍光タンパク質 / 心臓前駆細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
心臓オルガノイドは、素材細胞の再組立によって作ることができる。生体の心臓は、4種の主要なサブタイプ心筋（心房筋、心室筋、洞結節ペースメーカ細胞、刺激伝導系細胞）から構成されている。そこで、心臓オルガノイド作製のための基盤技術として、本研究では、ヒト多能性幹細胞（ES/ iPS細胞）を用いて、心臓の主要な構成要素である4種のサブタイプ心筋の選別採取法の開発および心臓オルガノイド作製を目標としている。
本年度は、前年度までに確立した新規分取法により、洞結節ペースメーカ細胞、心房・心室筋細胞を分取し、その電気生理学的特性、特異的マーカー遺伝子の発現などを解析した。その結果、①MLc2a/Mlc2v共陽性細胞として心房筋、Mlc2v単独陽性細胞として心室筋、HCN4/Shox2共陽性細胞として洞結節ペースメーカ型細胞が選択的に分取できることが分かった。これらの細胞を使って、簡便なミニ心臓モデル（心臓オルガノイド）を作ることが可能となり、電気信号には駆動制御機構など、心機能を探る実験系の開発を進めていきたい。
また、オルガノイド作製には、素材細胞の組み立て以外に、臓器幹細胞の特性を生かして、in vitroで幹細胞から臓器を発生分化させる方法もある。これまでに、HCN4陽性細胞として一次心臓領域（FHF）の前駆細胞が分取できるという予備的な実験結果が得られていた。各種マーカー遺伝子の発現を調べた結果、HCN4陽性細胞はFHF前駆細胞としての特性を持っていることが明らかとなった。加えて、Islet1を指標として、二次心臓領域（SHF）の前駆細胞が分取できることを明らかにすることができた。このように心臓を形作る2種の前駆細胞の分取に成功したので、これらを用いて、心臓がどのように形作られるのか、心臓オルガノイド作製のための基盤技術の開発へとつなげていきたい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに、（１）ミオシン軽鎖Mlc2vとMlc2aをマーカーとすることによって、心房筋と心室筋を、（２）HCN4イオンチャネルと転写因子Shox2をマーカーとすることによって、洞結節ペースメーカ型細胞（SAN細胞）を蛍光タンパク質によって選択的に可視化できるヒトiPS細胞株の樹立に成功していた。本年度は、新規に開発した可視化法により選択的に分取した細胞を用いて、マーカー遺伝子の発現、電気生理学的特性の解析を行った。その結果、HCN4/Shox2共陽性細胞として、SAN細胞が高純度に濃縮されること、電気生理学的に典型的な洞結節ペースメーカ細胞の特性を示すことを明らかにすることができた（論文投稿中）。また、一つのiPS細胞株から、Mlc2a/MLc2v共陽性細胞として心房筋細胞が、Mlc2v単独陽性細胞として心室筋が分取できること、それらの電気生理学的特性を明らかにした。さらに、心房筋への分化誘導効率を上げることができる培養条件も検討した（論文作成中）。
このように4種のサブタイプ心筋の中から3種（心房・心室、洞結節ペースメーカ）の選別採取法を開発に成功した。HCN4とMlc2vの共陽性細胞が、刺激伝導系細胞であるという予備的な実験結果が得られていたが、再確認することには成功しなかった。また、分取した心室筋の表現型の安定性についても、顕著な改善方法を見いだせなかった。
もう一つのオルガノイド作製法である前駆細胞からの心臓形成については、一次心臓領域（FHF）と二次心房領域（SHF）に存在する前駆細胞の可視化および選別採取に、それぞれHCN4とIslet1転写因子をマーカーとすることによって成功した。さらに、調整したFHFおよびSHF前駆細胞において、各種マーカー遺伝子の発現を確認することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）引き続き、4種のサブタイプ心筋のうち、調整法の目処が立っていない刺激伝導系細胞の分取法の開発を行う。コロナ禍のため、計画していたが実行していなかったminK（イオンチャネルのβ‐サブユニット）をマーカーとする可視化‐選別採取法の開発を試みる。具体的には、minK遺伝子座に蛍光タンパク質をノックインし、minKの発現を蛍光タンパク質によって可視化できるヒトiPS細胞株を樹立する。
（２）洞結節型ペースメーカ細胞と、心房・心室筋の分取が可能となり、それぞれが典型的な電気生理学的特性を示すことがわかったので、それらを組み合わせ、簡便なミニ心臓モデルを構築する。特殊心筋であるSAN細胞が生成する電気信号によって、作業心筋である心房・心室筋が収縮するin vitro細胞系の開発が目的である。心臓オルガノイド作製のための予備実験と位置づけ、ペースメーカ細胞からの電気信号の伝達様式、それに対応する作業心筋の応答性を検証する。
（３）HCN4によってFHF前駆細胞を、Islet1によってSHF前駆細胞を可視化‐選別採取することができる。そこで、選択的に分取したそれぞれの前駆細胞の発生分化能の検討を進める。具体的には、FHF/SHF前駆細胞から、どのサブタイプ心筋などが生ずるのかを、HCN4-EGFP、Mlc2v-mCherryなど、これまでに樹立した可視化できるiPS細胞株を用いて、蛍光タンパク質の発現を基に、①どのサブタイプ心筋が、どのタイミングで発生するのか、②それぞれの増殖と分化には、どのような因子がかかわっているのかなどを検討する。
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| Causes of Carryover |
本年度は、概ね計画通りの支出額となったが、コロナ禍のため令和2年度より65万円ほどを、繰り越していた。そのため、令和3年度も、40万円ほど次年度へ繰り越すこととなった。現在、研究は、かなり順調に進んでおり、心房筋、心室筋などを高純度で調整することができると考えている。そのため、分取した各種サブタイプ心筋の解析のため、マイクロアレイ解析など、外部機関への委託解析を積極的に行い、より詳細な解析を進めていきたいと考えている。これにより、繰越金及び当該年度の研究費を順調に使用することができると考えている。
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Research Products
(5 results)
