2020 Fiscal Year Research-status Report
毛細血管網を有する歯肉モデル組織を用いた歯周病菌感染機構の解明
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20K12646
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
佐々木 尚子 大阪大学, 工学研究科, 特任研究員(常勤) (10388762)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松崎 典弥 大阪大学, 工学研究科, 教授 (00419467)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | コラーゲンマイクロファイバー (CMF) / P. gingivalis / 上皮細胞層 / ジンジパイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯周病原因菌 P. gingivalis がどのようにして歯肉組織へ感染し、組織の深部へと移動後、血管へ侵入するのか明らかにするために、血管網構造を有する三次元歯肉モデル組織を構築し、感染した P. gingivalis の可視化および定量化を試みた。
コラーゲンマイクロファイバー (CMF) を用いて作製した三次元歯肉モデル組織に P. gingivalis を感染させ、組織内への移動距離と血管網構造付近での挙動を追跡した。感染 4 時間後、P. gingivalis は上皮細胞層だけでなく、結合組織層の上部まで侵入していた。感染 24 時間後には、結合組織層に局在する血管網構造まで到達することが確認できた。さらに、トリプシン様活性を持つジンジパインを欠損させた P. gingivalis を三次元歯肉モデル組織に感染させると、血管網構造まで到達している菌数が減少していた。このことから、ジンジパインが P. gingivalis の歯肉組織深部への移動と血管網構造への浸潤に関与している可能性が高いことが示唆された。
歯肉組織の防御機構において、上皮細胞層は菌の侵入に対して物理的バリアとして機能している。作製した歯肉モデル組織におけるバリア構造の形成について検証するために、細胞間接着や上皮細胞層の安定化に関わる 7 種の分子 (ZO-1, Claudin-1, Claudin-4, Occludin, E-cadherin, Laminin, Collagen IV) の発現における結合組織層中の CMF の関与について、リアルタイム PCR 法により検討した。その結果、CMF を含まない歯肉モデル組織では、Claudin-4 を除く全ての分子で発現が低下していたことから、結合組織層中の CMF が上皮バリアの形成に寄与していることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
三次元歯肉モデル組織の細胞外マトリックスに CMF を使用しているため、多重蛍光染色法による結合組織層深部へ侵入した P. gingivalis の観察法の確立が困難になることが予想されたが、透明化試薬を用い観察方法を工夫することで、血管網構造に局在している P. gingivalis を観察することができた。また、安定して血管網構造を有する組織に菌を感染させることが可能になったことから、今後、P. gingivalis の感染と血管網構造の関連性の解明につながる知見が得られると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
CMF の濃度を変えることで結合組織層の硬さを調整し、歯肉モデル組織への P. gingivalis の感染に結合組織層の硬さが影響するか免疫染色法を用いて経時時間変化で確認する。さらに、感染した組織中における P. gingivalis の菌数をリアルタイム PCR 法で解析し、P. gingivalis が感染組織中でも生存・増殖していることを検証することで、本モデルの有用性を確立する。
また、血管網構造と P. gingivalis の歯肉組織深部への侵入の関係性について検証を始める。結合組織層の血管網構造の有無で、P. gingivalis の侵入速度や程度が変化するか調べる。P. gingivalis の局在が血管網構造周辺に認められた場合、血管内皮細胞からの分泌因子が P. gingivalis の深部への侵入に関与している可能性が高い。そこで、培養培地中に分泌されている因子を探索し、誘引因子を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
参加予定であった国際学会が、新型コロナウイルスの影響によりオンライン開催へ変更されたため、旅費として計上していた予算が使用できなかった。また高倍率の顕微鏡レンズ購入予定であったが、観察方法を検討することで、現在所有しているレンズで観察できたことから、本年度での購入を見送った。
次年度に、組織標本解析や、タンパク質発現解析のための抗体を中心とした試薬の購入に使用する。また、幅広い実験条件を設定するため、歯肉モデル組織を作製するための材料が多く必要になるので、その購入に使用する。
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