オルタナティブな核酸医薬、スフェロイドによる核酸医薬産生

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K12651
• Research Institution: Osaka City University
• Principal Investigator: 立花 亮 大阪市立大学, 大学院工学研究科, 教授 (80305614)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: エクソソーム

Outline of Annual Research Achievements

核酸医薬として、細胞内で安定な環状RNAを生成する際、オートファジー関連タンパク質をノックダウンするとさらに環状RNA含有量が増加することを見出した。この現象は通常のmRNA分解系やナンセンス変異依存mRNA分解経路の関連タンパク質をノックダウンするより効果的であった。
次に、エクソソームによるデリバリー方法の開発として、エクソソーム表面に高発現するタンパク質として、PTGFRNを選択した。このタンパク質のエクソソーム外（N末端側）に標的細胞で発現するタンパク質（ここではEGFRを仮に選択した）に対するナノボディ7D12を提示することを行った。同時に、エクソソーム内（C末端側）にGFPを付加し、モニターできるようにした。エクソソームの精製について検討した。最もよく使われている超遠心法、ポリエチレングリコール沈殿法と遜色ない方法を考案した。中程度の濃度の亜鉛イオンを共存させることによって、エクソソームを上記２方法と同程度の回収率で生成することができた。しかも、夾雑物（血清中に含まれるタンパク質）などが非常に少ないと思われる。この方法は現在さらに検討中である。
このエクソソーム中にはshRNAに由来するRNAi関連分子、環状RNAなど核酸医薬を含有することを確認した。プリリミナリーな結果であるが、タンパク質をコードした環状RNAを含有し、それを上記システムによって標的EGFR発現細胞へデリバリーできた。標的細胞中で蛍光タンパク質の発現を確認した。
スフェロイドを体内に埋め込むことを考えた場合、何かに封入するべきであると考える。ゼラチン溶液を冷却し固化させたものの表面だけをグルタルアルデヒドで架橋した。内部は架橋されておらず、そこにエクソソーム発現細胞を注射筒で導入した。細胞は外部にはもれなかったが、産生したエクソソームは外部で検出できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

簡便なエクソソーム精製方法を考案できた。さらに効率をアップさせるよう詳細を検討中であるが、これまでのスタンダードな方法に比べ、手間が省け、効率が良いことがわかっている。これによって、研究がより進捗する。
エクソソームへの核酸の封入量の増加は必ずしもうまくいっていないが、エクソソームの標的細胞へのデリバリー効率は満足いく水準まで達している。核酸の封入量の増加はエクソソーム内のチャージの問題だと考えられ、現在これを解決すべく検討中である。
エクソソームデリバリーの方法として、ナノボディによる細胞表面への結合ができているが、他に、ポリヒスチジンペプチドによっても細胞表面への結合が促進されることを見出した。また、不確定ながら、ポリヒスチジンペプチドによって細胞内への透過が起こっているのではないかと思われる。エクソソームによるデリバリーの問題点の２つ（細胞への結合、透過）が一挙に解決できる可能性があり、評価に値すると考えている。

Strategy for Future Research Activity

エクソソームの標的細胞へのデリバリー効率は上がってきたものの、エクソソーム内の物質（タンパク質、核酸）が標的細胞の細胞質にどの程度移行しているかどうかが明確でない。リソソームへある程度送られ、分解されている可能性がある。細胞質へデリバリーされると蛍光タンパク質を再構成し、蛍光を観察できるシステムを導入して、この問題を定量化できるように計画中である。
エクソソーム表面のペプチド提示により、細胞への結合、および細胞への透過が促進されることを検討する。ポリヒスチジンペプチドは細胞への結合などを促進していると思われるデータがあるので、これを補強し、確定させて行きたい。エクソソーム表面の提示については、複数のペプチド、タンパク質の提示を行い、その最適な組み合わせを検討する。
亜鉛イオンによるエクソソーム精製方法の最適化を行い、より効率的に精製できるようにする。濃度、温度、時間、遠心方法、などの詳細を検討し、煩雑でない方法の確立を行う。

Causes of Carryover

コロナの影響で出張旅費が2年連続必要なかったことで次年度使用額が生じている。この額は物品費として有用に使用する予定である。