2021 Fiscal Year Research-status Report
Creation of carrier nanoparticles for intracellular delivery by Lab-on-a-Chip
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20K12656
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
武岡 真司 早稲田大学, 理工学術院, 教授 (20222094)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | アミノ酸型脂質 / マイクロ流体デバイス ナノ粒子 / リポソーム / フローマイクロ合成 / Lab-on-a-chip / 脂質ライブラリー / 薬物運搬システム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
優れた細胞内デリバリー能を持つキャリアナノ粒子は、薬物運搬システム（ＤＤＳ）の開発のみならず、核酸医薬品やゲノム編集における遺伝子治療用キャリア、そしてワクチンの開発においても重要である。本計画では、Lab-on-a-chipデバイスを用いて、Ａ．アミノ酸型脂質の合成、Ｂ．キャリアナノ粒子の調製、 Ｃ．キャリアナノ粒子による薬物の細胞内デリバリー評価 までのプロセスを連結させて、脂質や薬物の種類に応じたキャリアナノ粒子の最適化を多変量解析から行う。具体的には、Ａでは、フローマイクロ反応デバイスにて脂質各部を連結させて得られるライブラリーに対して、Ｂのマイクロ流体デバイスを用いて薬物担持キャリアナノ粒子（薬物内包リポソームや核酸複合脂質ナノ粒子）を構築し、Ｃのマイクロ流体デバイスを用いてキャリアナノ粒子と細胞を混合し薬物や核酸の細胞内デリバリーをフローサイトメトリーや共焦点顕微鏡の画像解析から評価する。各プロセスについて重回帰分析から各条件の最適化を高効率に行うことで、多様な構造の脂質と組成や大きさの異なるナノ粒子の分散液に対して、その細胞導入効果 を一挙に評価することができる。2021年度は、Ａ．確立したフローマイクロリアクタを用いた合成法が他の脂質に条件を調節すれば適用できることを確認し、スペーサー部を合成してライブラリーを充実させた。Ｂ．Herringbone構造のマイクロ流体デバイスでは、流路に目詰まりが頻度高く発生し、その除去や洗浄工程が煩雑になる課題が認められ、別構造・素材のマイクロ流体デバイスの探索を始めた。また、精製工程に供する中空糸モジュールを自作し、重回帰分析にて条件の最適化を行った。特に脂質収率は流路の前処理により向上すること見出した。Ｃ．細胞評価に関してはリポソーム添加後の細胞内カルシウム振動をＡＩによる画像解析する方法を想起した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2020年度はフローマイクロリアクターを用いてアミノ酸型脂質の合成を確立した。2021年度は、合成担当者が変わったので、再現性のチェックから本合成法の検討を行い、構造の異なるアミノ酸型脂質においても若干の条件調整によって同様に短時間で高収率が得られることを確認した。そして、アミノ酸型脂質の極性頭部、スペーサー、疎水性尾部のライブラリーにおいてスペーサー部の合成を行い、ライブラリーを充実させた。2022年度にはこれらを組合せた合成を実施する。他方、マイクロ流体デバイスを用いたリポソームに関しては目詰まりの問題に直面した。都度洗浄することで再現性良い結果が得られたものの、マイクロ流体デバイス自体の構造と素材（ガラスからステンレスへ）について検討を開始した。2020年度は、更にエタノールや未内包の分子を連続的に除去するミニチュア型中空糸モジュールを試作したので、2021年度はそれを用いてリポソームの調製から精製工程までを重回帰分析を行い、説明変数を特定するとともに最適化を図った。その結果、収率向上のための流路の前処理方法を見出した。また、リポソームと細胞との相互作用に関しては、細胞内のカルシウム振動が短時間で評価するのに適していることから、その動画をＡＩにて解析したところ特徴的なパターンに分類できることを見出した。リポソームの構成脂質の細胞内動態とカルシウム振動パターンをリンクさせる作業を開始した。以上より、研究を具体的に進めることによって、計画通り進んでいるところ、課題が見いだされてその解決策を進めているところ、新たな気づきによってより深堀できる可能性がでてきたところがあり、総合しておおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
アミノ酸型脂質のフローマイクロ合成に関しては、多くの反応条件を連続的に変化させることで収量や純度を最適化させることができる。 しかし、脱保護工程や精製工程がバッチ式であるので、フロー式で行うカラム精製装置と連結させる。 以上が確立できたところで、生成物の収率と純度を目的変数とし、各種フロー条件を説明変数とした多変量解析によって各ステップの合成の最適条件を設定する。その上で、各パーツのライブラリーからコンビナトリアルケミストリーを実践し、アミノ酸型脂質のライブラリを構築する。マイクロ流体デバイスを用いた薬物内包リポソームや核酸脂質複合ナノ粒子の調製法に関しては、新たな構造のマイクロ流体デバイスの設計と製造を経て、それを重回帰分析によって評価する。それと21年度確立した小型中空糸モジュールと組み合わせて、調製と精製、濃縮を一連のフローにて行う。得られたキャリヤナノ粒子はフローシステムによって培養細胞と混合し、細胞のカルシウム振動をリアルタイムで捉えると共に、蛍光標識した脂質によってリポソームの細胞内動態に関する知見を得る。さらにリポソーム内包薬物や核酸も別波長の蛍光標識して細胞内動態に関する知見を得る。更に内包薬物や核酸の機能は共焦点顕微鏡やフローサイトメトリ―を組み合わせて評価する。脂質の種類、濃度、内包薬剤・担持核酸の種類、濃度を変化させて細胞毒性や生理活性を評価し、結果を順次公表してゆきたい。また、これらの知見を連結させて、企業との共同研究も進めてゆきたい。
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Research Products
(5 results)
