2021 Fiscal Year Research-status Report
インクジェット技術を利用した細胞Durotaxis誘導基材作製の確立
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20K12661
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| Research Institution | Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology |
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Principal Investigator |
津留 美紀子 国立研究開発法人海洋研究開発機構, 海洋機能利用部門(生命理工学センター), 准研究員 (60399574)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | インクジェットパターニング / Durotaxis / ゼラチン / 酵素活性測定 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞が基材の硬さを認識し、軟から硬領域を指向し遊走する現象（Durotaxis）は、創傷治癒過程で起きる細胞と基質の相互作用や、幹細胞が基質の硬さで分化系統を決定するメカニズムなどへの関与が知られており、Durotaxis現象を詳細に解析し、誘導を制御できる足場材料を創成できれば、細胞の分化能を足場材料の物性から制御できると考えられる。そこで、細胞が認識できるマイクロスケールでの制御が可能な足場基材の設計技術が求められている。
本研究の目的：足場材料として採用したハイドロゲルの表面に、インクジェットパターニング技術を用いて極微量の加水分解酵素を極微量滴下し、酵素反応に伴い基材表面の弾性を変化させることで、弾性をフレキシブルに改変できるDurotaxis誘導足場基材の新しい設計方法を確立する。
研究実績：基材の弾性勾配を維持させて細胞遊走実験に進めるには、任意の弾性が得られた段階で、酵素反応を迅速に停止する必要がある。今回、耐熱性の高いグルタルアルデヒド(GA)で架橋したゼラチンハイドロゲルを用いて、酵素加水分解処理後に温水で洗浄することで酵素失活させる手法を検討したところ、酵素反応の停止を確認できた。得られたGA架橋ゼラチンハイドロゲルを原子間顕微鏡を用いて解析すると、酵素加水分解による形状を維持していた。精密な解析を行う上で、サンプル形状を原子間力顕微鏡測定に合わせる必要があったため、実験系を精査し治具の制作を進めた。今後はこの治具を用いて、酵素反応に伴う弾性変化を詳細に解析する予定である。また、ゼラチン以外の生分解性足場材料について本研究手法の活用を目指し、ポリL乳酸に注目し、このハイドロゲルの作製方法を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
酵素加水分解特性の解析にGA架橋ゼラチンハイドロゲルを用いた実験では、滴下実験時のGA架橋ゼラチンハイドロゲルの変形が著しく、再現性よい解析データが得られない状況になっている。このことから、実験系の再調整を進めているが、当初予定していた最適な実験データの取得と検証まで至らなかった。実験系の検討には、ゼラチンハイドロゲル物性の検証やインクジェット滴下時の前処理の確立など検討すべき課題が多い。そこで、一部実験計画を見直し、ゼラチンゲルによる酵素加水分解の特性実験と並行して、本研究技術を他の足場材料にも使用できるようにゼラチン以外のハイドロゲルで酵素加水分解による弾性改変ができるか検証することとした。今年度は、細胞培養足場材料として実績のあるポリL乳酸に注目し、ポリL乳酸ハイドロゲルの作製方法を確立したが、酵素加水分解の検討までには至らなかったため、少し遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
Durotaxis誘導可能な弾性勾配足場基材の設計条件を見出すため、以下の通り進める。
１）ゼラチン及びポリ乳酸のハイドロゲルについて、弾性勾配足場材料用の基材として使用できるように検討する。
GA架橋ハイドロゲルは、実験時の変形を抑えた湿潤状態を維持できる手法を検討し、酵素加水分解特性を検証する。再現性が得られない場合を想定して、他の架橋方法でのゼラチンハイドロゲルについても作製方法、酵素加水分解特性について検証し、ゼラチンハイドロゲルの弾性改変足場材料の設計手法について確立する。
ポリ乳酸については、昨年度検討したハイドロゲルが、研究代表者が確立した新規酵素活性測定を用いて弾性改変足場材料設定ができるよう、酵素反応条件及びマイクロパターニング条件などを検討する。
２）得られた弾性勾配足場材料について、原子間力顕微鏡を用いて表面弾性勾配の計測を行い、酵素反応条件との相関を検証する。得られた結果を基に、様々なインクジェット滴下条件、酵素反応条件で足場材料を作製し、細胞遊走実験を進める。
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| Causes of Carryover |
これまでの研究で、ハイドロゲルを用いた実験はサンプルの含水量がデータの再現性に大きく影響することがわかってきた。そこで、ハイドロゲルの湿潤状態を維持できる保湿チャンバーの作製を進めることとし、高精度な実験系の構築を進める。2022年度より本格的に原子間力顕微鏡を用いた弾性勾配の解析に着手する予定であることから、解析に必要な解析ソフトを導入する。また、本研究の推進に伴い、3Dコンフォーカル顕微鏡を用いた含水サンプルの測定に伴う知見を多く見出しており、これらの成果について学会などに積極的に参加・発表、情報交換を行い、更なる測定技術の向上を進める。
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