2021 Fiscal Year Research-status Report
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20K12711
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
高柳 泰 大阪大学, 医学系研究科, 寄附講座助教 (50578250)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 再生医療 / QbD / 特定細胞加工物 / 製造工程 / 無血清培養 / セルソーター / CQA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、2019年よりfirst-in-human臨床研究として移植治療を実施した特定細胞加工物：iPS細胞由来角膜上皮細胞シートを対象として、医薬品開発/製造設計におけるQuality by Design（QbD）の考え方を取り入れて、研究段階から実用化を見据えた製造工程の改良を実施することを目的としている。性質にばらつきの多い生体材料である細胞を主な原料とする対象製品の製造工程に対し、初めから全体にQbDの考え方を当てはめて検討することは困難であったため長期間にわたる工程の中でも、比較的管理のし易い最終工程：細胞シート作製工程を対象として検証実験を行い、管理対象とした培養条件と作製した細胞加工物の質の相関を調べた。当該工程では、前工程で作製、凍結したiPS細胞由来角膜上皮（前駆）細胞を起眠し、無血清培養と血清培養を経て、最終品であるiPS細胞由来角膜上皮細胞シートを作製することが出来る。これに対し、起眠時の細胞の播種密度、無血清・有血清での培養期間と、出来上がった細胞シートが適切な細胞密度を保った形態を保持しているか否かの相関を調べて管理手法の検討を行った。
その他、製造工程の改良の一環として、分化誘導後の細胞群から目的とする角膜上皮（前駆）細胞を純化するためセルソーターで分取する工程で用いる抗体３種類について、蛍光標識の組み合わせの見直しを実施する準備を整えた。
次年度以降は、これまでに取得したデータを元に考察し、不足するデータが有る部分には追加実験をして研究をまとめる方針である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞製品の製造工程へのQbD適用検討として、細胞の増殖やシート組織形成の状況を観察・管理し易い最終工程：細胞シート作製工程を対象に、製造における細胞の増殖ばらつきと、それを見越して適切な細胞シートを作ることが出来るかの検証を行った。当該工程では、凍結ストックしたiPS細胞由来角膜上皮（前駆）細胞を起眠し、前半は無血清培養で細胞を適切な量（sub confluent ~ confluent）まで増殖させたのち、後半は血清培養に切り替えて重層化による組織形成を促すことで、最終品であるiPS細胞由来角膜上皮細胞シートを作製することが出来る。この工程に対し、評価のし易い細胞密度を製品の重要品質特性（Critical Quality Attributes；CQA）と仮定し、細胞培養実施による検証を行った。初期は一定の播種密度と培養期間で培養を数回実施したところ、概ね同等の細胞シートが形成出来たものの、一部で細胞密度の低すぎる細胞シートが出来るケースが認められた。不適切な細胞シートの形成を回避するため、播種時の細胞密度と無血清培養期間を調整して、前半工程で適切な密度（sub confluent ~ confluent）まで細胞が増えた状態を確認したのちに、血清培養に切り替える様に変更したところ、管理適切な細胞密度を保持した細胞シートを形成することが出来た。また、血清培養期間は変動（３～7日間）しても、重層化した細胞シートを維持、形成出来ることも確認した。
また、製造工程の管理改良検討のための別の切り口として、前年度からの取り組みとして品質管理の要所となるCQAとなる管理値を見出すため、製品に含まれる幹細胞性の高い細胞の割合をホロクローンアッセイの応用により評価することを試みていた。しかし、同手法では対象製品の幹細胞性評価に対して有意性を見出せず、その検討方針は保留とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究開発の時点から事業化後の製造体制を想定した工程の作り込みを行う、Quality by Designの思想が医薬品開発では実装されつつある。細胞等の生体材料を用いる再生医療製品についても、同様の方針より効率的で堅牢な製品開発体制を整えるという考え方の取り入れが検討されるようになった。しかし主原料となる細胞の個体差や変動が大きいため、再生医療製品分野では本格的な運用にはまだ時間がかかるとみられている。これまでに対象の製造工程に対し、管理し易い工程を端緒として検証を実施し、細胞播種密度や培養期間などの管理項目を調整することで最終品のCQAとして仮設定した細胞密度を収束可能であることを確認した。今後さらに管理項目の変動幅を大きく振ってCQA収束の限界を図るなどを追加実施する。これらのデータを収集し、管理項目の基準を設定管理することで最終品の品質を担保可能な工程モデルを提示することを計画している。
また、細胞純化工程の改良も検討する。同工程で使用する3種類の抗体については、多重染色した際にセルソーターで相互の干渉を抑えて識別可能な蛍光標識の組み合わせを用いる必要がある。従来と異なる組み合わせで、セルソーターで検出可能な蛍光標識の抗体を準備したので解析純化効率の比較検証を行い、改良点が受け入れ可能かを調べる。
今後はこれらの検討結果を統合して、製造工程の改良、組み立てを試行する予定である。
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