遺伝子発現解析によるインフルエンザワクチンのin vitro安全性評価法の構築

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K12727
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 百瀬 暖佳 国立感染症研究所, 血液・安全性研究部, 主任研究官 (70415488)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: in vitro評価系

Outline of Annual Research Achievements

ワクチンは一般的に健康な人に予防的に接種されるため、我が国においては有効性のみならず安全性が特に重要視される。人に接種されるワクチンの安全性は動物実験等により評価される。投与後の動物に体重減少毒性等を惹起するワクチンは経験的に副作用が多いとされており、現在の動物実験ではこれら生体反応を安全性の指標としている。近年、厳重な管理の下で高品質なワクチンが製造できるようになり、動物実験は改良が求められている。我々は、体重減少等の生体反応に先立って動物の組織内で遺伝子発現が変動することを想定して検討を行い、インフルエンザワクチンの評価に資するマーカー遺伝子を同定している。本研究課題ではこれらマーカー遺伝子を用いた高感度in vitroアッセイ系の構築を目標としている。
2020年度はduplex qRT-PCRによる遺伝子発現解析法の導入を行った。インフルエンザワクチン処理後の細胞から調整したRNAを元にcDNAを合成し、インターカレーション法にてマーカー遺伝子の発現亢進を確認した。マーカー遺伝子3個と内標準遺伝子2個についてTaqManプローブを準備した。上述のcDNAを用い、各遺伝子のTaqManプローブによるqRT-PCRの結果が、インターカレーション法と同等であることを確認した。次に、内標準遺伝子と各マーカー遺伝子のduplex qRT-PCRを行ってデータを比較検討した。Duplex化によりPCRの増幅効率に影響が見られたものの、マーカー遺伝子の発現変動は概ねsingle plexと同等の結果が得られた。一方でduplex化により増幅曲線の異常を認めたマーカー遺伝子があり、再検討を行っている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

概ね計画通りに進めてはいるが、緊急事態宣言や試薬の調達遅延等の理由により一部の検討が次年度以降となったため。

Strategy for Future Research Activity

2020年に検討した各遺伝子のTaqManプローブを用いて、1ステップqRT-PCR法に適応できるか各遺伝子について検討する。適応可能であったものについては内標準遺伝子とのduplex化の検討を行い、1ステップ法によるduplex qRT-PCRを基にしたアッセイ系の構築を目指す。アッセイ系の簡便化に向けてmultiplex化等の検討を行う。アッセイ系の感度向上のため細胞そのものの反応性向上も目指し、サイトカイン/ケモカイン等の効果を検討する。

Causes of Carryover

研究状況が当初の計画よりやや遅延しているため。遅延分の検討は本年度に実施する。未使用分は次年度に繰り越した検討に必要な試薬等の購入に使用する。