遺伝子発現解析によるインフルエンザワクチンのin vitro安全性評価法の構築

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K12727
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 百瀬 暖佳 国立感染症研究所, 血液・安全性研究部, 主任研究官 (70415488)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: in vitro評価系 / ワクチン

Outline of Annual Research Achievements

ワクチンは一般的に健康な人に予防的に接種されるため、我が国においては有効性のみならず安全性が特に重要視される。人に接種されるワクチンの安全性は従来、動物実験等により評価されてきた。投与後の動物に体重減少等を認めたワクチンは経験的に副作用が多いとされており、動物実験では主に動物の生体反応を安全性の指標としている。一方、近年では厳重な管理の下で高品質なワクチンが製造できるようになり、動物実験は削減や改良が求められている。我々は、体重減少等の生体反応に先立って動物の組織内で遺伝子発現が変動することを想定して検討を行い、インフルエンザワクチンを評価するためのマーカーとなる遺伝子群を同定している。本研究課題ではこれらマーカー遺伝子を用いたin vitroアッセイ系の構築を目標としている。
2021年度は遺伝子発現解析法の簡便化に関する検討を行った。マーカー遺伝子と内標準遺伝子のduplex PCRについて、一部のマーカー遺伝子ではsingle plexと同等の結果が得られた。ただし、ワクチン添加前の発現量が低い場合など、PCRの増幅効率がsingle plexとduplexで大きく変化する遺伝子も認められた。プライマー/プローブの変更を含めてPCRの条件検討を行ったが、duplex PCRでは定量性の担保が困難なマーカー遺伝子を複数認めた。したがって、duplex化は保留としてsingle plexでの発現定量PCRの簡便化を目指し、total RNAからの1ステップPCR法へのバリデーションを行った。一方、これまで用いてきた上皮系細胞株は、インフルエンザワクチンに対する反応性は高いもののコントロールが難しく反応性にバラツキが見られることなどから、別の汎用細胞株への変更も検討している。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

緊急事態宣言や試薬等の調達遅延のため。また、これまでin vitro評価系の評価に使用してきた細胞株の変更を検討する必要性が生じたため。

Strategy for Future Research Activity

インフルエンザワクチンに反応性を有し、かつ安定した応答が得られる細胞株の再選定を行う。また、細胞ライセートからの遺伝子発現定量法などを検討することでRNA抽出ステップを省略または簡略化し、少ない操作で安定したデータを取得できるアッセイ系の構築を試みる。アッセイ系の感度向上に向けた取り組みとして、細胞の反応性向上を目指し、各種サイトカイン/ケモカイン処理、またはフィーダー培養等の効果を検討する。

Causes of Carryover

研究状況が当初の計画より遅延しているため。遅延分の検討は本年度に実施する。未使用分は次年度に繰り越した検討に必要な試薬等の購入に使用する。