2020 Fiscal Year Research-status Report
Use of bacteriophage therapy to control antimicrobial resistance bacteria during wastewater treatment
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20K14864
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| Research Institution | Hachinohe National College of Technology |
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Principal Investigator |
李 善太 八戸工業高等専門学校, その他部局等, 助教 (60771962)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 抗生物質耐性大腸菌 / 大腸菌ファージ / 下水処理場 / ファージセラピー / 存在実態 / 制御方法 / 薬剤耐性菌 / ファージ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
抗生物質の効かない細菌の薬剤耐性菌が世界中で問題になっている中で、薬剤耐性菌に感染するバクテリオファージ（以下、ファージ）を用いたファージセラピーが注目を集めている。しかし、薬剤耐性菌に感染するファージの存在実態についてはほとんど知見がない状況である。そこで本研究では、①下水処理場における薬剤耐性菌に感染するファージの実態調査、②薬剤耐性菌感染ファージを用いた下水処理場での制御手法の検討、③薬剤耐性菌に感染するファージ種の特定を目的とする。様々な薬剤耐性菌に感染するファージを収集して薬剤耐性菌感染ファージのライブラリを作製し、これらから調製したファージカクテルを添加することで、下水処理過程中に薬剤耐性菌の割合を減少させる。また、有効なファージはその種を特定することで、下水処理場だけでなく宿主である薬剤耐性菌が問題になっている、ヒト、動物、農業、食品および環境の各分野においても利用できることが期待される。
本年度は、下水処理場における薬剤耐性菌に感染するファージの実態調査を行うため、まず、宿主菌として用いる薬剤耐性菌として抗生物質耐性大腸菌に注目し、下水処理場に存在する抗生物質耐性大腸菌の調査を行った。試料としては、下水処理場の流入下水と活性汚泥処理後の二次処理水、また、その二次処理水を塩素消毒した放流水を用いた。流入下水から検出された抗生物質耐性大腸菌の中で、複数の抗生物質耐性を示す多剤耐性大腸菌を宿主菌として用い、流入下水中においてこれらの宿主菌に感染する大腸菌ファージの存在実態の調査を実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
宿主菌として用いる予定の抗生物質耐性大腸菌について、8種類の抗生物質（アンピシリン、セフジニル、レボフロキサシン、テトラサイクリン、カナマイシン、スルファメトキサゾール・トリメトプリム、ゲンタマイシン、イミペネム）を対象に、下水処理場の流入下水と二次処理水、また、塩素消毒後の放流水における存在実態を調査した。その結果、流入下水、二次処理水、放流水で検出された大腸菌株においては、それぞれ10%、20%、50%が１剤以上の抗生物質に耐性を示しており、下水処理が進むほど耐性割合が高かい傾向が示された。
流入下水から検出された2~5剤に耐性を示す多剤耐性大腸菌11株を宿主菌として用い、異なる二つの下水処理場（WWTP AとB）の流入下水を対象として、これらの宿主菌に感染する大腸菌ファージの存在実態を調査した。その結果、WWTP Aの流入下水では、宿主菌として用いた多剤耐性大腸菌11株に感染する大腸菌ファージは検出されなかった。一方、WWTP Bの流入下水では2剤、3剤、4剤、5 剤に耐性を示す多剤耐性菌に感染する大腸菌ファージが検出され、その存在濃度は0.5~2.8 log（PFU/mL）だった。宿主菌として用いた多剤耐性大腸菌は全てWWTP Aの流入下水から単離していることから、同試料（採水日は異なる）で大腸菌ファージが検出されなかったことが考えられる。一方、WWTP Bの流入下水では用いた宿主菌の11株の中、7株の多剤耐性菌に感染するファージが検出された。また、より多くの薬剤に耐性を持つ宿主菌ほど大腸菌ファージの検出率が高い傾向が見られたため（2剤: 3/9, 33%, 3剤: 7/18, 39%, 4剤: 3/3, 100%, 5剤: 3/3, 100%）、今後、より多くの宿主菌を用いて調査を継続していく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
薬剤耐性数別の大腸菌ファージの検出率から、より多くの薬剤に耐性を持つ多剤耐性大腸菌ほど大腸菌ファージに感染されやすく、除去されやすい可能性が示唆されたことから、より詳細を把握するため、より多くの宿主菌を用いて大腸菌ファージの存在実態を調査していく予定である。また，調査回数別の大腸菌濃度にばらつきが見られたことから、今後、同様の調査を継続し、採水時の季節や時間を比較することで原因を把握する計画である。
また、流入下水から単離した多剤耐性大腸菌に感染するファージを用いて下水処理過程における抗生物質耐性大腸菌の制御手法の検討を行う予定である。これまでの調査で検出された多剤耐性大腸菌に感染するファージを全て単離・精製して－80℃での凍結保存を行い、ファージストックを作製済みである。これらを用いて、下水と活性汚泥を用いた回分式の曝気実験を行い、調製したファージカクテルの添加有無における抗生物質耐性大腸菌の割合を調査し、その有効性を評価する予定である。さらに、ファージカクテルの添加有において薬剤耐性大腸菌の割合の低減効果が大きかったファージカクテルについては、それぞれ単独培養後、次世代シーケンスにより薬剤耐性菌に感染するファージ種の特定を行う。もし、これまで報告されていない新しいファージであった場合は、透過型電子顕微鏡（TEM）による形態学的特徴の観察や次世代シーケンスによる全遺伝子配列解読を実施し、新種の申請と特許の出願も行う計画である。
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| Causes of Carryover |
研究課題の遂行に必要な予算執行をした上で次年度使用額が生じた。金額が微少であるため次年度予算と合わせて使用する計画である。
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Research Products
(1 results)
