2021 Fiscal Year Research-status Report
革新的ハロゲン制御型ラクトン化酵素と有機触媒系ハイブリッド補因子の創製
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20K15103
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| Research Institution | Nagahama Institute of Bio-Science and Technology |
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Principal Investigator |
知名 秀泰 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 助教 (70570282)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 有機溶媒耐性酵素 / 非金属ブロモペルオキシダーゼ / BPO-A1 / 塩基性オリゴペプチド / ブロモラクトン化反応 / exo/endo選択性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、まず、更なる有機溶媒安定性の向上を目指し、Streptomyces aureofaciens由来のブロモペルオキシダーゼ（BPO-A1）のC末端へ様々なオリゴペプチドの導入を試みた。種々の極性アミノ酸のオリゴペプチドがpH9での有機溶媒安定性を高める中、His8、Arg8及びLys8などの塩基性オリゴペプチドは、著しく高い効果を示した。BPO-A1のC末端領域には疎水性コアが存在しており、付与したオリゴペプチドが酵素内部への有機溶媒の侵入妨害に寄与することを示唆した。尚、N末端へのHis8の導入は、酵素活性を低下させた。また、基質汎用性向上を目指し、基質ポッケト周辺の変異導入を試みたところ、通常の基質であるモノクロロジメドンに対するブロモペルオキシダーゼ活性は著しく低下した一方でブロモラクトン化活性は高まる変異体を得た。この結果は、基質ポケットの空洞は環化反応の反応効率に影響を及ぼすことを示した。更に、BPO-A1と同じ種由来のブロモペルオキシダーゼであるBPO-A2、Serratia marcescens由来のクロロペルオキシダーゼ（CPO）、及びAcinetobacter calcoaceticus由来のデヒドロクマリンヒドロラーゼ（DCH）におけるブロモラクトン化活性を検討したところ、何れもブロモラクトン化活性を有することが明らかになった。しかし、有機溶媒安定性およびexo/endo選択性におけるこれら類縁酵素とBPO-A1の比較は、何れにおいてもBPO-A1が最も優れていることを示した。本結果は、今後のブロモラクトン反応の効率化および反応選択性の制御において重要なヒントになり得る。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では、Streptomyces aureofaciens由来の非金属ブロモペルオキシダーゼのBPO-A1が極性アミノ酸のオリゴペプチドのC末端付与によって有機溶媒安定性を向上させることを見出した。この結果は、C末端付近の疎水性コアが影響していることを示唆すると共に、有機溶媒安定性の向上を目的としたオリゴペプチド付与の戦略が有用であることを示した。一方、酵素活性においては、基質ポケットの空洞がブロモラクトン化反応の重要な要因であること、および幾つかの類縁酵素においてもブロモラクトン化活性を有することを明らかにし、また有機溶媒安定性およびexo/endo選択性においてBPO-A1が類縁酵素よりも優れていることを示した。ただし、幾つかの変異酵素において発現ホストを検討したものの、可溶性画分への発現に成功できていないものが多くある。また、exo/endo選択性を強く制御する部位が未だ明らかになっていない。現存する有機化学的ブロモラクトン化反応と比べ酵素学的ブロモラクトン化反応の優位性を示すためには、特にendo環化に有用な酵素の開発に注目する必要があるが、BPO-A1の類縁酵素でendo環化選択性が高まった結果を得たばかりである。今後、実用可能な高選択的endo環化型ブロモペルオキシダーゼの開発を志向し、まずはBPO-A1のendo環化選択性を高める変異部位の探索を優先することが望ましい状況である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本課題は、（１）基質ポケットの拡大による基質汎用性の改善、（２）酸耐性酵素の開発、（３）異種変換による新規脱ハロラクトン化酵素の創製、および （４）超原子価ヨウ素補因子の創製、の４つで計画しており、詳細を下記に示した。
（１）に関しては、基質ポケットおよびその入り口付近にあたる嵩高いアミノ酸残基において変異導入の検討を続けると共に、複合的な変異導入も試みる。現在、ブロモラクトン化反応における高選択的なexo環化をBPO-A1で実現しているが、今後は高選択的なendo環化型酵素の開発に着手する。endo環化選択性に影響を及ぼす部位を探索すると共に、複合的な変異導入によりendo環化選択性を段階的に高めていく予定である。（２）においては、種々の類縁酵素のpH安定性を比較し、効果的な変異導入部位の模索を行う。また、酵素表面上の酸性アミノ酸および塩基性アミノ酸部位における変異導入を検討する。更に、力学的な観点から人工的なジスルフィド結合の導入を既に試みたが、分子生物的手法による可溶性画分への発現誘導が困難であったため、無細胞タンパク質合成システムによる発現誘導を試みる。（３）においては、触媒機構上で基質の不飽和カルボン酸と一時的に結合するS95の近辺への変異導入を試みる。また、脱ハロラクトン化反応を触媒する酵素への異種変換にも取り組む。（４）においては、化学的な選択的修飾法を利用し、基質ポケット近辺に超原子価ヨウ素補因子の化学修飾を検討する。
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