Development of luminescence indicator of transcript abundance using RNA recognition module

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K15395
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 河村 玄気 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 特任研究員 (10852791)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 発光タンパク質 / RNA認識 / 転写物

Outline of Annual Research Achievements

本研究では, RNA認識モジュールおよび発光タンパク質の組み合わせを利用することにより, 任意の転写物を発光によって検出するプローブの開発に取り組んでいる. このプローブに求められる性質としては任意のRNAを認識すること, およびRNAに対する認識を発光シグナルに変換することがあげられる. そこで, RNA認識モジュールが転写物と結合した結果生じるRNA認識モジュールの構造変化を利用し, 構造変化に伴って発光タンパク質の発光能変化をもたらすことで目的に合致するプローブを開発することにした.
まず, RNA認識モジュールが標的とする転写物を認識するかどうかを確認した結果, RNA認識モジュールは標的となる転写物を認識し, かつ, その認識能は特異的であることが明らかとなった. 次に, RNAに対する認識を発光シグナルに変換するため, RNA認識モジュールの適切なアミノ酸残基に発光タンパク質を挿入することにした. まず, 予測されるRNA認識モジュールの立体構造を基にRNA認識モジュールが転写物と結合することにより構造変化が生じることが期待されるアミノ酸残基を推定した. 次に, 推定した部位候補に遺伝子工学的手法により発光タンパク質をRNA認識モジュールに導入したプローブを複数種類構築した. これらプローブの標的転写物存在下での発光量を測定したところ, 発光が観測された. しかしながら, 現在観測されている発光値の変化は標的転写物の量の変化を測定するためには小さいため, さらなる改良が必要となる. 今後は発光タンパク質の挿入部位やアミノ酸残基の置換により開発したプローブの性能の向上を図る.

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初めに, 研究の計画に従いRNA認識モジュールと発光タンパク質ルシフェラーゼを用いて融合したプローブを遺伝子工学的手法により構築した. 次に, 構築したプローブが任意の標的転写物を認識できることを確認するため, RNA認識モジュールの標的転写物に対する認識能を検証した. RNA認識プローブが標的転写物に結合すると標的転写物からの翻訳を阻害する仕組みを利用し, RNA認識能の評価系を確立した. この評価系を用いて標的RNAを認識するRNAの種類を変更した際の標的RNAの翻訳阻害能を検証したところ, 共発現させた認識RNAと翻訳阻害効果には一定の相関関係がみられた. また, 将来的な応用を検討している時計タンパク質を標的とした認識モジュールにおいても翻訳阻害効果が検証された. 標的以外の転写物の翻訳阻害効果は見られなかったことから構築したRNA認識モジュールは標的転写物を特異的に認識することができていると考えられる. 次に, RNA認識モジュールへの最適な発光タンパク質ルシフェラーゼの挿入位置の検討を行った. そこで, 研究計画当初のタンパク質構造予測によって候補としたRNA認識モジュールに存在するループ位置二か所それぞれに対し, 挿入位置を変更したプローブ群を構築した. 結果, プローブ由来の発光は観測されたものの, 標的転写物の存在の有無で発光値の変化が顕著に観測されるプローブ候補の特定には至らなかった. この結果は挿入位置の最適化, 加えて挿入ループの最適化が必要であることを示唆している. 以上の結果から, 開発した系を任意の転写物を発光によって検出するプローブとして確立するためにはさらなる改良が必要であると考えられる.

Strategy for Future Research Activity

今後は, 開発した系を任意の転写物を発光によって検出するプローブとして確立するために, 発光値変化が標的転写物の存在量に応じて大きく変化するプローブを見出すこと, また, 開発するプローブの標的RNAに対する特異性や汎用性について詳細な検討を行うことが必要になる. これらを達成したのちに, 時計タンパク質に対する応用を試みる. まず, RNA認識モジュールの予測されるタンパク質構造を再検証したところ, 新たな挿入候補ループ位置を見出した. そこで現在までに得られているプローブの最適化を行うとともに, 新たな挿入候補位置に対するプローブ候補の構築を進めてより性能の良いプローブの選抜を行う. また, 発光タンパク質の構造変化の最適化が困難である可能性も考えられる. そこで, タンパク質の構造変化を観測可能なシグナルに変換する系として蛍光タンパク質の利用の検討を行う. 具体的には, 発光タンパク質を蛍光タンパク質に置き換えたプローブの構築を行う. 今後は発光型のプローブの開発を進めると共に蛍光型のプローブも視野に入れてプローブの開発を進める. RNA認識モジュールの特異性, 汎用性に関しては生化学的な手法により実際のプローブの標的転写物への結合を確認する. 具体的には, 観測シグナルと生化学的手法によって定量した実際の転写物量との比較を行う. また, 開発するプローブでは時間変化を観測できることが特徴の一つであるため, 転写物の経時変化を検証するデータを取得し比較を行う. 具体的には刺激依存的に存在量が変化する転写物を標的として選択し, 刺激前後での実際の転写物量変化とプローブのシグナルとを比較検討を行う.

Causes of Carryover

本研究では, 消耗品として主に遺伝子工学的手法によるプローブ構築, および, プローブの細胞実験に関わる経費を計上している. このうち, 細胞実験に関わる実験に関して特に費用のかかる試薬等の使用を検討していたが, 昨年度の研究では主に遺伝子工学的手法によるプローブ構築の段階にとどまったため細胞実験関係の消耗品に関わる費用は当初の予定よりも少なくなった. また, 新型コロナウイル対策による学会の中止や一部研究活動への支障があったため, 計上した予算通りには研究計画が進められなかったことも一因である. 次年度の研究では昨年度計画通りには進められなかった細胞実験を主に行い, さらに生化学的実験による検証実験も計画しているためこれらの実験に次年度使用額を当てたいと考えている.