2020 Fiscal Year Research-status Report
光応答性修飾核酸塩基を用いたSNA光ライゲーション法の開発
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20K15399
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
村山 恵司 名古屋大学, 工学研究科, 助教 (70779595)
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2020-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 人工核酸 / 光架橋 / SNA / ライゲーション / RNA検出 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
光応答性修飾核酸塩基PVA(8-pyrenylvinyl adenine)の光架橋反応を用いて、鋳型特異的にSNA断片を光で連結させる「SNA光ライゲーション法」を開発することを目指し研究を進めた。
末端にPVAを導入したSNA 2配列を合成し、PVAが向かい合いうように鋳型配列上で二重鎖形成をさせ、光照射を行った結果、PVA同士の光架橋反応が進行し、光ライゲーションに成功した。この設計においては、ライゲーションにより二重鎖が解離し、別の断片が鋳型と二重鎖形成することで、１つの鋳型に対し繰り返し連結反応が進行することを期待していた。しかし、PVA同士の強固なスタッキング相互作用により、鋳型配列非存在下でも非特異的にSNAの連結が起こってしまうことが明らかとなり、鋳型の効果が正確に評価できなかった。
非特異的な光架橋反応を抑制するために、新たな光応答性塩基としてよりスタッキング相互作用が弱いと予測されるNVA(8-naphthylvinyl adenine)を設計・合成した。まずは1本のSNA鎖にNVAを2残基導入して光反応性を評価した結果、PVA同様に光照射によって光架橋反応と二重鎖の解離が起きていることが確認された。さらに別の波長の光照射による架橋開裂反応と二重鎖の再形成も確認された。更にPVAとNVAは、照射する光の波長を制御することで互いに独立して架橋・開裂を行うことができる。この直交性を利用して、２つのSNA/RNA二重鎖の二重鎖形成状態と解離状態・計４状態を光照射によって作り分けることに成功し、新たな光駆動形核酸分子マシンの開発に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
最初の目標であった、PVAを用いたSNA光ライゲーション法の構築には成功した。これを用いた応用に向け、その反応特異性を改善する必要が出てきたため、新たな光応答性核酸塩基NVAの設計を行い、その合成に成功した。光応答性核酸塩基の修飾官能基による光反応性の違いは大きくなく、様々な分子設計が可能であるという知見が新たに得られた。
また、当初の計画にはなかったが、NVAはPVAと異なる波長の光で制御できるという非常に興味深い特徴を活かし、直交性をもつ光駆動形核酸分子マシンの開発に成功し、論文化することができた。
上記の通り、研究は当初の計画以上に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
新たに開発したNVAを用いてSNA光ライゲーション法の構築を行う。PVAで実現可能性は確認できているため、NVAに変更することで鋳型配列非存在下での非特異的連結反応が抑制されることを期待する。これを利用し、標的RNAを鋳型としてSNA光ライゲーションを行うことで、1分子のRNAに対して複数のライゲーション産物を生成するシグナル増幅を行う、RNAの高感度検出システムを構築する。また、環状RNAに対してSNA光ライゲーションを行い、環状RNAを軸として環状SNAが連なったポリカテナン構造の作成も試みる。更に、新たな光応答性核酸塩基の合成も行い、修飾官能基と光架橋の反応性との関連性についての知見を深めたい。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染拡大防止の為、出張ができず旅費が0となった。そのため、次年度に繰り越した。当初の計画時点で翌年度の消耗品分予算が不足気味であったため、そちらに利用する。
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