2022 Fiscal Year Annual Research Report
遠縁種間の微生物二次代謝産物生産を可能にする人工生合成遺伝子の創製
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20K15410
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
橋本 拓哉 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (10783714)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 人工遺伝子クラスター / NRPS / コドン最適化 / 環状ペプチド化合物 / Gタンパク質阻害剤 / 生合成 / 放線菌 / 二次代謝産物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
難培養微生物の遺伝子を望む宿主内で発現させられれば、培養出来ない微生物が生産する有用物質を組換え微生物によって生産させることが可能になる。そのために、化合物生産に関わる遺伝子を発現させる技術の確立が必要である。本研究はChromobacterium属細菌の生産するYM-254890を題材とし、グラム陰性細菌由来のペプチド化合物をグラム陽性細菌である放線菌内で生産することを目指して検討を行った。YM-254890の生合成遺伝子クラスターについて、合成DNAを利用した人工生合成遺伝子クラスターの作製を検討した。Chromobacterium属細菌のYM-254890生合成遺伝子クラスターを鋳型として、放線菌での発現に適したコドン頻度となるように放線菌型コドンへコドン変換した各遺伝子の配列をデザインした。本遺伝子クラスターにはytfA-Hまでの8つの遺伝子が含まれる。これらの各遺伝子について、放線菌のコドン頻度へとコドン変換を行った。次に変換した遺伝子を、元の生合成遺伝子クラスターの順に再配置した。その際、翻訳カップリングについても最適化を行い、40 kb長の人工遺伝子クラスターを設計した。設計した遺伝子クラスターを構築するために、全長を断片化し1 kbずつの合成DNA断片を設計した。設計した各DNA断片を化学合成によって取得した。シームレスクローニングを繰り返して断片を段階的につなぎ合わせ、完全長の人工生合成遺伝子クラスターの作製に成功した。構築した人工遺伝子クラスターを各種放線菌に導入し、発現を試みたが、発現が確認出来なかった。そこで発現最適化について検討した。プロモーター挿入位置を複数にしたコンストラクトや、翻訳を効率化させるための配列の挿入を検討したが、YM-254890の生産は見られなかった。
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