2022 Fiscal Year Annual Research Report
難発現性モリブデン酵素の汎用的異種発現系の確立と機能解析
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20K15432
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
竹内 道樹 京都大学, 農学研究科, 特定助教 (40766193)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | モリブデン酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
モリブデン酵素は、様々な反応を触媒するユニークな酸化還元酵素であり、その反応の多様性から、幅広い分野に応用可能な酵素である。しかしながら、多くの場合、酵素精製が困難であり、また、大腸菌での発現が難しく、汎用的に使える遺伝子工学的基盤の構築が求められている。本研究では、「難発現性モリブデン酵素を活性型で異種発現できるシステムの構築」を行い、「モリブデン酵素の機能解析」へ応用することで、モリブデン酵素の学術的知見を広げる。さらには、環境分野や、健康分野といった様々な分野へと展開していく。
前年度において、モリブデン酵素の一つであるポリフェノールデヒドロキシラーゼ遺伝子について、Rhodococcus erythropolisにおける異種発現を検討したところ、コドン頻度を最適化することで、活性のある状態での異種発現に成功した。このことから、本年度では、Clostridium由来アルデヒドデヒドロゲナーゼについて、コドン頻度の最適化を実施し、異種発現の検討を行った。SDS-PAGEでは発現が確認できなかったが、活性評価に供した。活性評価方法としては、電気化学測定のサイクリックボルタンメトリーを使用した。アセトアルデヒド添加時のメチルメチルビオロゲンをメディエータとする酸化触媒電流、還元触媒電流の有無で活性評価した。一度は触媒電流が観察されたものの、再現性が取れずR. erhthropolisでの異種発現に成功したとは言い難い結果となった。菌体における発現量や活性発現が安定しないのがその要因と考えられ、培養条件の検討や、菌体濃度を上げる工夫などが解決方策としてあげられる。
また、モリブデン酵素の応用について検討すべく、Clostridium由来アルデヒドデヒドロゲナーゼが関与する、藍染め染色液を用いて、基質であるインジゴを検出するセンサの構築を検討し、成功した。本成果については、論文を投稿・報告した。
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Research Products
(1 results)
